《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Advancements of Homogeneous Immunoassays and Applications in Bioanalytical Chemistry
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•本综述首先按机制对均相免疫分析进行分类，并界定其应用范围。•本文批判性地评估了不同均相免疫分析中的物理极限和灵敏度权衡问题。•本文在免洗探针设计与临床、食品、环境和POCT应用之间架起了桥梁。引言免疫分析在现代医疗和生命科学研究中不可或缺，但日益变化的需求对传统分析模式构成了越
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本综述首先按机制对均相免疫分析进行分类，并界定其应用范围。
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本文批判性地评估了不同均相免疫分析中的物理极限和灵敏度权衡问题。
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本文在免洗探针设计与临床、食品、环境和POCT应用之间架起了桥梁。
引言
免疫分析在现代医疗和生命科学研究中不可或缺，但日益变化的需求对传统分析模式构成了越来越大的挑战，而传统模式难以满足这些需求。在复杂的生物基质中进行稳健检测是当务之急，因为传统的洗涤步骤会引入显著的可变性并增加分析物损失的风险[1]。与此同时，向分散化诊断的转变要求开发出适合即时检测环境的快速、一步式操作流程。此外，对全面生物标志物谱分析日益迫切的需求要求从微量样本中进行多重检测，而对早期疾病检测的追求又不断推动对痕量级靶标终极灵敏度的要求[2], [3]。以酶联免疫吸附测定（ELISA）为代表的传统异相分析，由于其本质上依赖固相分离、多次孵育和洗涤循环，且多重检测能力有限，从根本上与这些需求不匹配（图1A）。其他免疫分析技术，如化学发光免疫分析（CLIA），虽然灵敏度有所提高，但仍依赖于复杂的仪器和多步操作流程[4]；而侧向层析试纸条虽然能够提供快速、即时使用的结果，但定量准确性和灵敏度较差[5]。这些不足以及日益扩大的性能需求推动了均相免疫分析的发展，其核心创新在于样本混合后无需额外的分离或洗涤步骤即可完成分析（图1B）。这种“混合-测量”范式巧妙地消除了分离步骤，从而解决了速度、复杂性和适应性等关键瓶颈问题[6], [7]。本文将均相免疫分析在操作上定义为：样本混合后无需额外分离或洗涤步骤的分析方法[8], [9]。这一定义既涵盖本体液相反应，也包括分隔化形式，如数字免疫分析和悬浮阵列，其中物理隔离被整合到分析设计中，而非作为混合后的独立操作进行[10], [11]。因此，均相免疫分析的定义性特征是无需额外的分离或洗涤步骤，而非缺乏物理分隔。
均相和异相免疫分析的主要区别在于其分析流程，这相应地影响信号产生、分析性能、操作复杂性以及适用于不同应用的特性[12]。均相形式通常在处理速度和操作简单性方面具有优势，而异相形式利用分离或洗涤步骤去除未结合组分，这可以在某些分析设计中提高信噪比[13]。然而，这些差异并非普遍适用，具体取决于特定的分析架构和分析情境。表1总结了均相和异相免疫分析的关键差异及其各自的优势和局限性。在此背景下，随着简化分析流程和改善分析性能的努力持续塑造免疫分析技术的发展，均相免疫分析已引起越来越多的研究兴趣[14]。
迄今为止，免疫分析领域的这种范式转变清晰地反映在该领域不断发展的研究轨迹中。首先，明显趋势是从以实验室为中心、依赖仪器的工具转向可在分散化环境中运行的现场部署型、自动化、用户友好的系统，包括资源有限环境和即时检测场所。其次，生物系统日益增长的复杂性以及对全面生物标志物谱分析的需求，推动了对多重分析的高度重视。从少量样本中同时定量数十种分析物的能力正日益成为必需。第三，为应对困扰临床和实际样本（血清、全血、食品提取物）的持续自发荧光和散射背景，该领域已策略性地转向无激发信号机制，如生物发光共振能量转移（BRET）和化学发光共振能量转移（CRET）。这些方法无需外部光源，从而内在抑制光学噪声，并提高复杂基质中的有效灵敏度（图1C）。这些技术也随之发展（图1D）。目前已形成平衡的组合，既包括成熟、完善的平台，如荧光偏振（FP）和某些基于荧光共振能量转移（FRET）的均相分析，它们可靠地服务于常规高通量筛选和分析；也包括纳米材料增强能量转移系统、CRISPR整合分析和仪器辅助的数字计数等新兴创新，它们正推动灵敏度、多重能力和可部署性的边界。总的来说，这些发展不断扩展现代免疫检测的可实现范围，从实验室规模研究到临床诊断、食品安全和环境监测的实际应用[15]。
本综述全面审视了支撑这种“混合-测量”能力的均相免疫分析。综述首先考察基于能量转移的方法学，这是核心类别，包括FRET及其无自发荧光类似物BRET和CRET，以及利用新型纳米材料的新兴平台。然后，讨论扩展到其他关键技术，包括FP免疫分析[16]、邻近分析法（如扩增发光邻近均相分析，AlphaLISA）[17]、智能设计的淬灭体（Q-body）系统[18]，以及先进设备的超灵敏领域[19]。阐明了每种技术机制的物理和化学限制，例如FRET偶极取向因子的不确定性以及BRET/CRET中低背景与高灵敏度之间的区别。此外，这些平台在基本原理和适用场景方面的关系也在统一框架内呈现。进一步地，通过纳入免洗探针的最新进展，本综述将均相免疫分析置于更广泛的分析视角中，揭示了与免疫分析平台信号转导逻辑平行的设计原则。最后，我们比较了这些平台的应用和相对优势，评估了它们当前的局限性，并讨论了未来方向。特别地，本综述强调与微流控、纳米技术和数字系统的整合如何塑造下一代分散化和可及的生物分析（图2）。临床诊断、食品安全、环境监测、药物筛选和基础生命科学研究的研究人员将在这里找到适合其特定分析应用的均相免疫分析“工具箱”。
章节摘要
基于能量转移的技术
基于能量转移的均相免疫分析共享一个共同原理。抗原-抗体对的特异性结合调节能量供体和受体之间的距离或取向，从而改变共振能量转移的效率。根据能量源的性质，这些方法可分为三类。FRET依赖外部光源激发荧光供体。BRET使用生物发光酶供体。而CRET采用
应用与新兴趋势
在讨论不同均相免疫分析平台的基本原理和设计特征之后，对其关键分析性能参数进行系统比较对于理解其在实际应用中的相对优势和局限性至关重要。表2总结了这些平台在分析灵敏度、分析时间、多重检测能力、样品基质耐受性、仪器和试剂需求等方面的报告性能，以及
持续存在的技术局限性
均相免疫分析尽管具有变革性优势，但仍面临持续存在且相互关联的挑战，这些挑战界定了该领域当前的前沿。
首先，基质干扰仍然是一个基本制约因素，因为血清或细胞裂解液等复杂生物样本中的成分可通过自发荧光、散射或淬灭效应引起非特异性信号调节[111], [112], [113], [114], [115]。虽然时间分辨和无激发方法能缓解这些
结论
均相免疫分析无疑改变了生物分析的格局，确立了一种以操作简单性、速度和自动化兼容性为特征的新范式。本综述讨论的多样化技术平台范围从成熟的FRET和FP方法到高灵敏度的数字计数方法和具有快速信号响应的Q-body分析。这种从多步骤、依赖分离的协议向简化、免洗和
CRediT作者贡献声明
张凯：写作 – 审阅与编辑。 高涛：写作 – 审阅与编辑。 严洁瑜：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，调查，正式分析，数据管理，概念化。 张涛：验证，监督。 韩坤：写作 – 审阅与编辑，监督，资源，资金获取
资金
本工作受中国科学院战略性先导科技专项资助（编号：XDA0620200）。
利益冲突声明
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严洁瑜|张涛|张凯|高涛|韩坤
