《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Recent Advances in Isothermal Amplification Technologies for Cancer Liquid Biopsy
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•等温扩增技术有望推动癌症液体活检的发展。•总结了癌症液体活检中的检测挑战及等温扩增技术的应用。•讨论了等温扩增技术用于癌症液体活检的临床转化所面临的挑战。•展望了未来发展方向：多重检测、数字化、自动化及人工智能分析。引言癌症是一种高度异质性疾病，其发生和发展受多种因素影响，包括
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等温扩增技术有望推动癌症液体活检的发展。
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总结了癌症液体活检中的检测挑战及等温扩增技术的应用。
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讨论了等温扩增技术用于癌症液体活检的临床转化所面临的挑战。
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展望了未来发展方向：多重检测、数字化、自动化及人工智能分析。
引言
癌症是一种高度异质性疾病，其发生和发展受多种因素影响，包括基因组改变、表观遗传调控以及肿瘤微环境变化[1]。早期诊断、动态监测和精准治疗是改善患者预后、提高生存率的关键策略[2]。目前，临床癌症诊断主要依赖影像学检查和组织活检。影像学检查通过检测结构异常来识别肿瘤病灶，但通常需要肿瘤生长到一定大小才能被可靠地显影，从而限制了其对早期微小病灶的检出能力[3]。组织活检虽然能提供关于肿瘤组织病理学特征和分子谱系的关键信息，并作为癌症诊断的基石，但其作为一种侵入性操作，存在诸多局限性，包括取样困难、活检标本代表性有限以及无法全面捕捉肿瘤异质性[4]。在此背景下，液体活检作为一种有前景的工具应运而生，以弥补传统方法的不足。
在肿瘤进展、耐药发生或微小残留病灶出现过程中，体液中的生物标志物改变往往先于影像学变化，这使得液体活检有助于识别影像学方法尚无法检测的病理状态[5]，[6]。液体活检通过定期采集包括血液、脑脊液、唾液、胸腔积液、腹水和尿液在内的体液样本，采用无创或微创操作，实现疾病的实时动态监测[7]。通过捕获源自多个肿瘤部位的循环生物标志物，液体活检能够克服传统组织活检的空间局限性，从而更全面地评估系统性肿瘤异质性和分子特征[8]，[9]，[10]。目前，大多数研究集中于基于血液的液体活检，其核心检测靶标包括体液中的核酸、细胞和细胞外囊泡（EVs）[11]。作为一种实时、微创且全面的癌症检测技术，液体活检已成为肿瘤学领域具有巨大发展潜力的关键工具[5]。
然而，液体活检也面临诸多挑战。液体活检中的主要靶标在体液中通常含量稀少，并与复杂的背景成分共存，包括来自非肿瘤来源的核酸、蛋白质和血细胞，这给准确、灵敏的检测造成了巨大障碍[12]，[13]。目前用于液体活检核心靶标的常规检测方法存在设备成本高、操作流程繁琐、灵敏度欠佳以及捕获效率不足等问题，这些因素共同阻碍了其满足即时检测（POCT）和精准诊断的临床需求[14]，[15]。随着临床对肿瘤治疗中检测灵敏度和特异性的需求日益增长，该领域亟需技术进步。在此背景下，等温扩增技术（IATs）作为解决这些局限性的有前景的方法应运而生。等温扩增技术无需复杂且昂贵的设备，同时具有较高的扩增效率[16]，某些方法可在短短15分钟内完成扩增[17]。一项研究报道了基于LAMP的电化学分析法用于ctDNA检测[18]。在临床验证中，组织结果与下一代测序（NGS）完全一致，血清ctDNA结果与微滴式数字PCR（ddPCR）完全一致，两者均实现了100%的灵敏度和特异性。每例完整患者分析的成本和周转时间（约37欧元，<2小时）远低于且短于ddPCR（约115欧元，>6小时）和NGS（约140欧元，>1天）。这些发现凸显了基于等温扩增技术的方法在癌症液体活检临床诊断中的潜力。此外，除常规核酸扩增外，等温扩增技术通过与适配体识别和免疫亲和捕获相结合，已越来越多地应用于液体活检，能够检测非核酸靶标，包括循环肿瘤细胞（CTCs）和细胞外囊泡（EVs）[19]。其应用不仅限于信号放大，温和的反应条件、灵活的设计以及与小型化检测平台的兼容性，使其能够适应多种生物标志物类型和检测场景[20]，[21]。这些特征为将灵敏的生物标志物识别与可及的诊断平台相结合奠定了基础，支持基于等温扩增技术的液体活检的潜在临床转化。
总之，等温扩增技术可以通过提高检测效率、降低成本，实现快速准确的疾病诊断和监测，从而增强癌症液体活检的分析性能和临床适用性。与以往聚焦于单一等温扩增技术或单一液体活检靶标的综述不同，本综述采用整合的视角。不同的临床场景需要匹配的等温扩增技术；级联扩增可提供更优越的性能，多靶标分析可为跨类型联合检测提供见解，并有助于克服肿瘤异质性的挑战。因此，我们不仅限于一种等温扩增技术或单一液体活检分析物。我们系统比较了多种等温扩增技术策略，并根据生物标志物的生物学特性分析了合适的等温扩增方案。近期研究以表格形式总结，标明其是否经过真实临床样本验证。我们进一步讨论了多重检测、定量准确性和标准化相关的关键挑战和未来前景。通过整合最新进展与对当前局限性和未来机遇的批判性评估，本综述旨在为基于等温扩增技术的癌症液体活检方法的临床转化提供见解。
章节摘要
循环肿瘤核酸
循环肿瘤核酸（ctNAs）代表在生物体液中检测到的一组肿瘤来源的核酸种类，包括ctDNA和ctRNA。这些分子反映肿瘤特异性的基因组和转录改变，其分析潜力推动了液体活检领域的广泛研究[22]。值得注意的是，癌症患者血液中的cfNAs水平高于健康个体[23]。
ctDNA是指肿瘤细胞脱落到
等温扩增技术
等温扩增技术在等温条件下运行，通常仅需简单的水浴或电阻加热元件即可启动反应并实现核酸信号扩增[59]。与PCR等传统核酸扩增方法相比，等温扩增技术不仅省去了复杂且昂贵的热循环仪器的需求，还提供了更优越的系统兼容性和检测灵活性，能够分析多种类型的生物标志物。由于其温和的
等温扩增技术在癌症液体活检生物标志物中的应用
本节综述了等温扩增技术在癌症液体活检生物标志物检测中的最新研究进展，重点关注ctNA、CTC和EV的检测挑战及近期进展。它还描述了多项独立研究报告的检测性能，包括检测限（LOD）、线性范围、回收率和临床性能。需要指出的是，不同研究报告的定量指标并不统一，
从单靶标到多重检测：应对肿瘤异质性
肿瘤的高度异质性使得单一生物标志物分析难以全面反映疾病状态[146]。目前，基于等温扩增技术的检测正从单靶标定性或定量分析向多重检测转变，旨在通过整合多维分子信息来提高诊断准确性和可靠性[147]。然而，多重检测不仅仅是靶标数量的增加；靶标之间的交叉反应
结论
等温扩增技术凭借其高效的信号放大能力、温和的反应条件以及与即时检测平台的良好兼容性，非常适合作为分子诊断工具。为系统概述等温扩增技术在癌症液体活检中的最新进展，本综述总结了近期基于等温扩增技术的癌症液体活检生物标志物检测策略（表S1–S4），涵盖扩增方案、靶标富集策略和关键分析性能参数。该
CRediT作者贡献声明
宋志锐： 写作——原稿，调查，正式分析，数据管理，概念化。朱秋波： 写作——审阅与编辑，监督，资金获取，概念化
利益冲突声明
作者声明他们不存在已知的可能影响本论文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。
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在准备本工作期间，作者使用了ChatGPT来改进手稿的语言和可读性。在使用这些工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。
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宋志锐|朱秋波
