线粒体靶向舍曲林（Mito-Sert）通过VDAC1介导的过度线粒体自噬抑制非小细胞肺癌

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Mitochondria-targeted sertraline (Mito-Sert) suppresses non-small cell lung cancer through VDAC1-mediated excessive mitophagy

　　

电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1, VDAC1）是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）线粒体代谢的关键调节因子，其表达升高，并在肿瘤能量学及化疗耐药获得中发挥重要作用。对公共数据集和临床标本的分析显示，VDAC1表达增加与肺癌不良预后相关。然而，能够抑制肿瘤生长的有效VDAC1调节剂的开发仍是一个未满足的需求。在本研究中，研究人员提出Mito-Sert，一种线粒体靶向的舍曲林（sertraline）衍生物；其通过调节VDAC1在肺癌细胞中诱导线粒体自噬，同时对所测试的非恶性肺细胞模型显示出有限细胞毒性。Mito-Sert在体外显著抑制肺癌细胞的增殖、迁移和成球能力，并在体内抑制异种移植瘤生长，伴随过度线粒体自噬、ATP耗竭和凋亡。Mito-Sert通过结合VDAC1，调控IP₃R（1,4,5-triphosphate receptor）/GRP75（glucose-regulated protein 75）/VDAC1钙离子通路并增强线粒体-内质网接触（mitochondria-endoplasmic reticulum contact, MERC），从而招募ULK1，启动一条不同于PINK1/Parkin的新型线粒体自噬通路。这些发现将VDAC1相关的线粒体质量控制确定为亲本及顺铂耐药NSCLC模型中的可靶向脆弱点，并支持将Mito-Sert进一步开发为线粒体靶向线粒体自噬诱导剂。

该论文发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，围绕非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的线粒体代谢脆弱性，研究线粒体靶向舍曲林（Mito-Sert）通过电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1, VDAC1）诱导过度线粒体自噬（mitophagy）的抗肿瘤作用及机制。研究背景方面，肺癌仍是全球高发恶性肿瘤和癌症死亡的主要原因，晚期非鳞NSCLC常采用顺铂联合培美曲塞治疗，但晚期患者5年生存率仍较低，治疗耐药是核心难题。既往肿瘤代谢常以Warburg效应解释，但近期研究提示包括NSCLC在内的部分肿瘤依赖线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS），肺腺癌尤其明显；线粒体代谢还参与耐药和干细胞样肿瘤细胞形成。线粒体质量控制依赖合成与降解平衡，线粒体自噬可清除受损线粒体，但过度线粒体自噬可耗竭线粒体池、损伤OXPHOS并损害高度依赖线粒体代谢的肿瘤细胞。VDAC1位于线粒体外膜，调节代谢物、Ca²⁺、ATP、ADP和活性氧（reactive oxygen species, ROS）等通行，并与1,4,5-三磷酸肌醇受体（inositol 1,4,5-triphosphate receptor, IP₃R）和葡萄糖调节蛋白75（glucose-regulated protein 75, GRP75）形成Ca²⁺调控轴；其高表达与多种癌症相关，敲低可降低ATP并逆转恶性表型。舍曲林（sertraline, Sert）可通过拮抗VDAC1诱导自噬、降低ATP并调控AMPK/mTOR，但单用抗肿瘤活性不足，可能与线粒体靶向性不够有关。因此，研究人员以三苯基膦阳离子（triphenylphosphonium, TPP⁺）修饰Sert构建Mito-Sert，旨在增强线粒体靶向和VDAC1调节，诱导NSCLC过度线粒体自噬。该研究的意义在于将VDAC1相关线粒体质量控制作为亲本及顺铂耐药NSCLC的可靶向脆弱点，并支持Mito-Sert作为线粒体靶向线粒体自噬诱导剂的开发。

技术方法概述（不超过250字）：研究人员分析公共TCGA数据（含510例LUAD和496例LUSC）及2012—2014年中山大学附属第五医院70例肺癌切除标本，评估VDAC1表达与预后；合成并表征TPP⁺偶联Sert；使用A549、A549-CDDP、MRC-5和BEAS-2B细胞，结合siRNA/shRNA敲低VDAC1、PINK1、PRKN和ULK1；采用Western blot、免疫荧光、免疫金电镜、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、流式细胞术（JC-1、mt-mKeima、Annexin V/PI）、Seahorse耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）、ATP检测和RNA-seq；采用药物亲和响应靶点稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）、细胞热位移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）和分子对接；开展克隆形成、成球、划痕、A549异种移植、H&E/免疫组化（immunohistochemistry, IHC）/TUNEL及短期毒性评估。

研究结果如下。3.1 VDAC1过表达与肺癌不良预后相关：通过TCGA数据、组织芯片IHC和临床随访分析发现，肺癌组织VDAC1表达高于正常肺组织，并与晚期TNM分期及较短生存相关；A549和A549-CDDP细胞中VDAC1高于MRC-5，提示其作为治疗靶点的可行性。3.2 Mito-Sert抑制所测试模型中的肺癌细胞生长和迁移：研究人员合成并表征Mito-Sert，通过克隆形成、成球、划痕、凋亡和细胞周期实验发现，Mito-Sert在低浓度即抑制A549和A549-CDDP细胞增殖、成球和迁移，诱导浓度依赖性凋亡及Sub-G₀群体增加；对MRC-5和BEAS-2B的细胞毒性有限，且对A549-CDDP的作用强于顺铂或Sert。3.3 Mito-Sert诱导的细胞死亡与过度线粒体自噬和ATP耗竭相关：抑制剂实验显示氯喹和环孢素A可阻断Mito-Sert诱导的细胞死亡，而Z-VAD和MG132不能；巴弗洛霉素A1减轻COXII降解、部分恢复ATP并减少凋亡。JC-1、mt-mKeima流式、EGFP-mCherry-COX8、Western blot和TEM显示Mito-Sert诱导Δψ_m丢失、线粒体自噬和线粒体清除，Sert仅诱导一般自噬；OCR和ATP检测显示Mito-Sert降低OCR和ATP，氯喹或环孢素A可逆转，且对MRC-5作用较弱。3.4 Mito-Sert诱导的线粒体自噬伴随NSCLC细胞中MERC重塑和AMPK–mTOR通路调控：RNA-seq显示Mito-Sert改变线粒体内膜、表面和通道蛋白及能量代谢基因表达，ITPR1 mRNA降低，并富集自噬及内质网过载相关通路；共聚焦、TEM和Rhod-2 AM检测显示MERC及线粒体-溶酶体接触增加、线粒体碎裂、线粒体Ca²⁺积累和自噬体捕获线粒体；免疫荧光和免疫金电镜显示LC3、ULK1、WIPI2和ATG16L1被招募至去极化线粒体；Western blot显示AMPK激活并抑制mTOR-S6K-S6信号，AMPK抑制剂减弱线粒体自噬。3.5 VDAC1是Mito-Sert诱导的完整线粒体自噬反应所必需：敲低VDAC1后，Mito-Sert诱导的AMPK激活、S6抑制和COXII降解减弱；JC-1、mt-mKeima、TEM、ATP、OCR和EGFP-mCherry-COX8实验显示线粒体自噬、膜电位丢失、ATP/OCR下降以及凋亡、迁移和成球抑制均依赖VDAC1；敲低VDAC1本身即引起线粒体损伤和凋亡，Mito-Sert不再进一步增加相关效应。3.6 Mito-Sert与VDAC1相互作用：DARTS和CETSA显示Mito-Sert浓度依赖性提高VDAC1水解稳定性和热稳定性，而不提高β-actin稳定性；DIDS抑制Mito-Sert诱导的COXII降解和S6K-S6磷酸化抑制，ITRA则呈协同作用；分子对接显示Mito-Sert的TPP⁺进入VDAC1口袋并与LYS61、ARG63、GLU40等作用，Sert支架与LYS32、LYS61、THR33和GLU40作用，DIDS结合位点邻近Mito-Sert，提示存在竞争。3.7 Mito-Sert促进VDAC1与ULK1及IP₃R-GRP75的相互作用：共聚焦、双免疫金和免疫共沉淀显示Mito-Sert使LC3、ULK1、WIPI2和ATG16L1与VDAC1在线粒体共定位，但仅促进VDAC1与ULK1互作，而不促进其与Parkin、LC3、FIP200、ATG16L1或WIPI2互作；敲低PINK1或Parkin不阻断COXII降解，抑制ULK1则减轻COXII降解、ATP耗竭和凋亡；Mito-Sert促进IP₃R–GRP75–VDAC1复合物形成，DIDS抑制而ITRA促进这些互作，支持非经典ULK1相关、以VDAC1为中心的线粒体自噬。3.8 Mito-Sert诱导的线粒体自噬驱动细胞死亡并在体内抑制肿瘤生长：A549异种移植中，2 mg/kg Mito-Sert显著抑制肿瘤生长，而50 mg/kg Sert无效，治疗期间未见明显体重下降；H&E、IHC和TUNEL显示肿瘤细胞死亡增加、cleaved Caspase-3升高、Ki67降低；Western blot和共聚焦显示AMPK激活、COXII降解、LC3与线粒体共定位以及VDAC1–ULK1、VDAC1–IP₃R和VDAC1–GRP75共定位增强；短期毒性评估中血液学和血生化未见明显异常；ADMET预测提示口服开发性有限、血浆蛋白结合高、可能存在CYP介导代谢和肝脏风险，支持本研究中非口服给药。

讨论部分总结：VDAC1高表达于多种癌症并参与线粒体代谢、线粒体自噬和凋亡，是肺癌潜在靶点，但靶向VDAC1并诱导致死性线粒体自噬的线粒体靶向小分子仍有限。Sert多与化疗药联用，单用主要诱导一般自噬，可能具有保护性并限制抗肿瘤效果；Mito-Sert通过线粒体靶向将弱保护性自噬转化为过度、致死性线粒体自噬。DARTS、CETSA、分子对接和药理调节支持Mito-Sert与VDAC1结合；DIDS与Mito-Sert结合位点邻近并竞争，ITRA不竞争。VDAC1敲低与Mito-Sert作用机制不同：敲低去除通道蛋白导致代谢崩溃，Mito-Sert更可能调节VDAC1活性/构象，触发线粒体去极化、线粒体自噬和凋亡，故其不是简单VDAC1抑制剂而是功能性调节剂。研究未设计确定线粒体自噬与耐药获得或维持的关系，但显示Mito-Sert诱导的过度线粒体自噬破坏线粒体稳态，并在亲本及顺铂耐药NSCLC模型抑制肿瘤细胞生存。Mito-Sert诱导的线粒体自噬主要不依赖经典PINK1/Parkin通路，而与ULK1相关；MERC及IP₃R–GRP75–VDAC1复合物促进自噬体形成，线粒体分裂和接触重塑与ULK1依赖性线粒体自噬协同。LUAD中VDAC1与ULK1、IP₃R和GRP75表达正相关，提示这些复合物可能成为肺癌治疗靶点；同时仍需干性标志物、耐药获得模型及药代毒理研究进一步验证。

研究结论翻译：本研究提出Mito-Sert作为线粒体靶向的VDAC1小分子调节剂，在标准及顺铂耐药NSCLC模型中具有显著抗肿瘤活性。通过将舍曲林与线粒体靶向部分TPP⁺偶联，研究人员显著增强其线粒体蓄积，并选择性诱导癌细胞发生耗能性线粒体自噬，同时不损伤正常肺上皮细胞和成纤维细胞。Mito-Sert通过调节MERC、激活AMPK–mTOR信号并促进VDAC1相关复合物组装发挥抗肿瘤作用，最终触发过度线粒体自噬和能量耗竭。这种靶向线粒体质量控制的策略为NSCLC（包括耐药肿瘤模型）提供了潜在治疗途径。研究人员的发现为VDAC1调节如何利用NSCLC细胞线粒体脆弱性提供了机制见解，并将Mito-Sert确定为未来转化开发的有前景先导化合物。这项工作为开发临床适用的线粒体靶向治疗药物用于NSCLC及其他难治性恶性肿瘤奠定了坚实基础。