氧化普鲁兰多糖-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠杂化纳米颗粒用于胡椒碱递送：基于分子动力学模拟的合理设计

《International Journal of Biological Macromolecules》：Oxidized pullulan–zein–caseinate hybrid nanoparticles for piperine delivery: Rational design supported by molecular dynamics simulations

　　摘要
多糖具有独特的分子支架功能，能够显著增强蛋白质基纳米载体的稳定性和功能性。在本研究中，我们通过计算与实验相结合的策略，证明了氧化普鲁兰多糖对玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸盐纳米颗粒具有关键的稳定作用。分子动力学模拟首先揭示了普鲁兰多糖能够促进广泛的氢键形成、降低构象波动并使蛋白质组装体更加致密，从而预测其增强结构完整性和pH响应性行为。这些模拟为氧化普鲁兰多糖与蛋白质之间的相互作用提供了互补的分子层面见解，与实验考量相结合，为后续纳米颗粒体系的开发提供了支撑。氧化普鲁兰多糖通过席夫碱化学共价结合至酪蛋白酸盐，并整合到玉米醇溶蛋白纳米颗粒中。实验表征确认了选择性氧化、高效的酪蛋白酸盐-氧化普鲁兰多糖偶联以及聚合物主链的保留，所得纳米颗粒具有均一的尺寸（约220 nm）、窄的多分散指数、高再分散性，以及在生理和富血清条件下的显著胶体稳定性。疏水性抗癌剂胡椒碱被高效包封，表现出持续的、pH触发的释放行为（在pH 5.5下释放率可达约73%），与预测的多糖介导的稳定化作用一致。体外细胞毒性实验显示其对MDA-MB-231细胞具有优先抗肿瘤活性（IC?? = 129 μg/mL），而对正常成纤维细胞（IC?? = 176 μg/mL）毒性较低。共聚焦显微镜显示MDA-MB-231细胞中的细胞相关荧光高于HFF细胞，与差异性的细胞结合行为一致。综上所述，这些发现证明了普鲁兰多糖功能化蛋白质纳米颗粒能够提供改善的稳定性、再分散性和pH依赖性药物释放，同时具有差异性的细胞结合能力，支持其作为蛋白质-多糖纳米载体在抗癌药物递送中的潜力。

引言
多糖是可再生、生物相容且可生物降解的大分子，其化学官能团易于修饰以调控载体行为。它们丰富的反应性基团（如羟基，以及某些多糖中的羧基）可实现药物包封和基质稳定化的共价或非共价策略，从而保护不稳定的治疗药物免于降解、增强溶解度和口服/全身生物利用度，并促进跨黏膜和细胞屏障的转运。此外，簇糖苷效应使糖基载体能够与特定靶标进行多价结合，从而实现高度精准的递送。这些特性共同使多糖基材料成为先进药物递送系统中极具吸引力且被广泛研究的平台[1]、[2]、[3]。

在天然多糖中，普鲁兰多糖因其水溶性、生物相容性和显著的化学稳定性而成为药物递送的有前景候选材料，这些特性共同支持其在纳米制剂设计中的应用。其黏膜黏附特性增强了组织相互作用和细胞摄取，从而支持高效且持续的递送[4]。普鲁兰多糖还可因其主链上高密度的羟基而被选择性氧化，产生能够与含氨基蛋白质和肽形成席夫碱键的醛基官能团，这种修饰可产生具有可控药物释放特性的稳定交联结构。在结构上，普鲁兰多糖是由通过α(1→6)键连接的麦芽三糖单元组成的中性均多糖，易溶于水介质，而在大多数有机溶剂中溶解度有限。每个重复单元上的九个羟基不仅为酯化和酰胺化等化学官能化提供了多样化的位点，还提供了高碘酸介导氧化所需的邻二醇结构，产生随后与含氨基生物分子形成席夫碱的醛基。这种内在反应性构成了普鲁兰多糖高效氧化/偶联能力的基础，并拓宽了其生物医学应用范围[5]、[6]、[7]。这些综合特性使氧化普鲁兰多糖成为一种多功能结构基序，能够增强各种疏水性生物材料的稳定性、响应性和靶向能力，从而推动具有改善功能性能和设计灵活性的下一代杂化纳米载体的开发。

玉米醇溶蛋白是玉米的主要醇溶蛋白，是一种结构异质的蛋白质，由α-、β-、γ-和δ-组分组成[8]，富含两亲性螺旋结构域，有利于溶剂置换过程中的自组装[9]、[10]。这些特性通过强烈的疏水和氢键相互作用，能够实现疏水性治疗药物的高效包封和持续释放[8]。尽管具有这些有利特性，玉米醇溶蛋白的固有疏水性及其接近中性的等电点（约6.2）显著损害了其胶体稳定性，促进了颗粒间的缔合和在水溶液及生理环境中的聚集[8]。这种内在不稳定性推动了互补稳定化策略的发展，其中酪蛋白酸钠被广泛用作玉米醇溶蛋白纳米颗粒形成和初级胶体稳定化的共组装伙伴[11]。尽管酪蛋白酸盐能够有效稳定新制备的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，但基于蛋白质的界面稳定化可能无法完全防止脱水和随后的复溶过程中不可逆的颗粒间缔合。在此背景下，共价锚定多糖组分不仅有助于纳米颗粒的形成，还能引入额外的水合和空间保护界面层，从而提高组装结构在加工和再水化条件下的稳健性。因此，多糖代表了一类多功能的互补稳定化材料，不仅能够增强胶体完整性，还能引入额外的功能，如环境响应性和控释特性。

在这一更广泛的功能领域中，通过醛基生成和随后的席夫碱偶联进行多糖氧化，已成为增强水合层、加强空间稳定化以及改善玉米醇溶蛋白基纳米载体整体环境适应性的特别有效策略。重要的是，多糖在蛋白质界面的共价锚定还可能在脱水-再水化循环过程中提供更强的结构保护，这对于开发可储存的纳米颗粒制剂具有实际意义。此外，蛋白质-多糖杂化体利用两种生物聚合物的互补优势，相较于单组分体系，能够提供更优异的稳定性、溶解性、生物相容性和生物活性化合物的控释性能[12]、[13]。基于这一原理，已开发出多种三元玉米醇溶蛋白体系以利用协同稳定化作用。例如，具有改善溶解性、抗氧化活性和界面性质的玉米醇溶蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯-海藻酸盐偶联物[14]；表现出优异胃肠道稳定性和姜黄素与白藜芦醇控释的玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸盐-氧化葡聚糖纳米颗粒[15]、[16]；以及通过pH调节和加热制备的玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸盐-果胶体系，该体系产生尺寸均匀、强电荷、耐pH的颗粒，通过疏水、氢键和静电相互作用稳定[17]。然而，多糖在玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸盐组装体中调节蛋白质间相互作用的机制基础仍然知之甚少，尤其是在原子尺度上。这种分子层面的见解对于下一代具有可编程稳定性和功能性的三元纳米载体的合理工程化至关重要。因此，我们采用分子动力学（MD）模拟来阐明氧化普鲁兰多糖的掺入如何重构和稳定玉米醇溶蛋白-酪蛋白二聚体，为后续实验设计提供预测性框架。

分子建模和模拟已成为纳米载体工程中不可或缺的工具，能够深入理解动态分子相互作用的机制，同时克服传统实验方法在空间和时间上的局限性。这些计算策略通过预测分子修饰如何影响稳定性、结构组织和生物学性能，促进聚合物基递送系统的合理设计，从而减少对劳动密集型试错方法的依赖[18]。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在决定多组分纳米载体的功能属性（包括胶体稳定性、溶解性和聚集行为）方面尤为重要；然而，其瞬时性和动态性往往无法通过标准分析技术获取。MD模拟能够提供这些相互作用的原子分辨率，实现时间构象变化的监测、稳定化力的识别和结合能的预测[19]。尽管基于生物信息学的分析和分子对接先前已研究了酪蛋白或玉米醇溶蛋白与小分子（如纳他霉素）之间的相互作用[20]，但迄今为止尚无研究利用MD模拟在存在大分子稳定剂的情况下探讨玉米醇溶蛋白与酪蛋白的直接相互作用，也未将这种计算见解转化为引导性的纳米载体开发。

在此，我们首次引入了计算-实验整合框架，其中MD模拟最初用于阐明氧化普鲁兰多糖如何在原子尺度上重构和稳定玉米醇溶蛋白-酪蛋白二聚体，指导后续三元纳米载体体系的合成。基于模拟得出的预测，我们提出氧化普鲁兰多糖与酪蛋白酸盐之间通过醛基介导的席夫碱偶联能够增强水合层、加强空间排斥并优化界面相互作用。重要的是，引入C–OP的目的不是取代酪蛋白酸盐作为玉米醇溶蛋白纳米颗粒形成的主要组分，而是克服酪蛋白酸盐稳定化体系中可能持续存在的问题，特别是在脱水和后续复溶过程中。共价接枝的OP链旨在提供纳米颗粒界面处持久的水合和空间屏障，从而减少冻干过程中的不可逆颗粒间缔合，并促进再水化后的有效再分散。这一区分很重要，因为新鲜制备分散液的胶体稳定性和脱水-再水化过程中的结构稳定性代表了不同的制剂挑战。因此，C–OP的价值在于其作为功能性界面改性剂的作用，扩展了酪蛋白酸盐稳定的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的性能，而非其对纳米颗粒形成本身的必要性。为实现这种共价偶联，普鲁兰多糖必须首先被氧化以引入能够与酪蛋白酸盐氨基形成席夫碱键的反应性醛基。这种共价接枝策略与简单添加氧化普鲁兰多糖或非共价多糖稳定化方法有根本区别。非共价吸附可能导致部分或可逆的表面覆盖，而共价偶联则确保多糖链稳定锚定在蛋白质基质界面，从而促进改善的水合作用、更强的空间稳定化和增强的胶体稳定性[16]。

这一假设通过成功的普鲁兰多糖氧化和共价偶联得到了实验验证，并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、滴定法、质子核磁共振（1H NMR）和OPA分析进行了确认。值得注意的是，氧化普鲁兰多糖的掺入不仅改善了胶体完整性并实现了脱水后的再分散性，还引入了pH响应性释放机制，为纳米载体增添了智能功能维度。该纳米载体在pH 7.4条件下表现出工程化胶体稳定性，同时在弱酸性肿瘤微环境（pH 6.2）和溶酶体条件（pH 5.5）下呈现pH响应性释放曲线，支持其在癌症相关酸性条件下递送胡椒碱以及通过EPR效应进行被动肿瘤靶向的潜在适用性[21]。所得的酪蛋白酸盐-氧化普鲁兰多糖修饰的玉米醇溶蛋白纳米颗粒（Zein/C–OP NPs）表现出可调的理化特性、控释行为，以及对乳腺癌细胞相较于相应非癌细胞模型增强的细胞毒性活性，支持了MD引导设计策略的有效性。综上所述，这项工作确立了合理纳米载体工程中的开创性范式，展示了如何利用蛋白质-多糖相互作用的原子级模拟来构建具有增强稳定性和适应性的下一代智能递送系统。为清晰和一致性起见，本研究后续统一使用标准术语：氧化普鲁兰多糖（OP）、酪蛋白酸盐（C）、胡椒碱（Pip）和酪蛋白酸盐-氧化普鲁兰多糖偶联物（C–OP）。

材料与方法
材料
普鲁兰多糖（Mw ≈ 100 kDa）和酪蛋白酸钠（来源于牛乳）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。纯化玉米醇溶蛋白（Mw ≈ 20 kDa）、邻苯二甲醛（OPA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、四硼酸钠、硼酸、氯化钠（NaCl）、磷酸氢二钠（Na?HPO?）、磷酸二氢钾（KH?PO?）、氯化钾（KCl）、台盼蓝、甲醛（37%）、碳酸氢钠和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自Merck（德国达姆施塔特）。

分子水平相互作用分析
为阐明生物聚合物组装体的分子缔合和动态行为，进行了分子对接和MD模拟。在所有计算分析中，“普鲁兰多糖”特指氧化形式的普鲁兰多糖（OP）。在计算模型中使用了包含氧化衍生官能团的代表性OP片段。对接和MD模拟旨在表征分子缔合、结构稳定性和非共价相互作用。

结论
在本研究中，我们证明了通过席夫碱反应将氧化普鲁兰多糖共价偶联至酪蛋白酸盐，是增强玉米醇溶蛋白纳米颗粒理化稳定性和功能性的有效策略。优化的Zein+Pip/C–OP纳米载体表现出均一的粒径、高胶体稳定性、冻干后优异的再分散性，以及生理相关条件下的pH响应性胡椒碱释放。改善的再分散性进一步

CRediT作者贡献声明
Fatemeh Moazeni：写作——初稿、可视化、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Atefeh Pourhossein：写作——审阅与编辑、写作——初稿、验证、监督、资源、项目管理、概念化。Shokouh Rezaei：写作——初稿、可视化、软件、正式分析。Fatemeh Bagheri：写作——审阅与编辑、验证、监督、方法学。Seyed Abbas Shojaosadati：写作——审阅与编辑。

同意发表
不适用。

伦理批准与同意参与
不适用。

资助
本研究由伊朗国家科学基金会资助（资助号：4015683）。

利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。

致谢
作者感谢塔比阿特·莫达雷斯大学提供实验室设施的支持。

Fatemeh Moazeni | Atefeh Pourhossein | Shokouh Rezaei | Fatemeh Bagheri | Seyed Abbas Shojaosadati