人胸苷激酶1的pH依赖型结构动力学与催化功能

《International Journal of Biological Macromolecules》：pH-dependent structural dynamics and catalytic function of human thymidine kinase 1

　　•对人类胸苷激酶1（hTK1）的pH依赖性结构和功能变化进行了系统表征。
•hTK1在pH 8.0时表现出最大的结构稳定性和催化活性。
•酸性pH诱导部分解折叠并增加疏水区域的暴露。
•碱性条件促进构象扰动和蛋白质聚集。
•分子动力学揭示了pH依赖性的柔性、氢键和溶剂可及性变化，这些变化是活性丧失的基础。

引言

脱氧核糖核苷激酶（dNKs）是一类催化脱氧核糖核苷磷酸化生成相应单磷酸酯的酶，是通过补救途径参与DNA前体生物合成的关键酶[1]。细胞脱氧核糖核苷酸的供应主要通过两条途径维持：从头合成途径（从小的代谢前体合成核苷酸）和补救途径（回收预先形成的核苷并节约细胞资源）[2]。根据底物和细胞定位的不同，主要的dNKs包括胸苷激酶1（TK1）、胸苷激酶2（TK2）、脱氧胞苷激酶（dCK）、脱氧鸟苷激酶（dGK）以及dTMP激酶相关酶。

其中，hTK1是由四个相同亚基组成的同源四聚体蛋白，每个亚基约25 kDa，形成总分子量约100 kDa的球状复合物[3], [4]。该酶的单体亚基由约234个氨基酸组成，采用与核苷激酶中常见的RecA ATPase家族结构域相关的典型α/β折叠亚基结构（图1）[5]。hTK1是嘧啶补救途径的一种酶，催化ATP依赖性的胸苷（TdR）磷酸化生成胸苷5′-单磷酸（TMP），随后生成胸苷单磷酸（dTMP），最终通过进一步磷酸化γ-ATP（γATP）生成胸苷（dThd）而参与脱氧胸苷三磷酸（dTTP）的形成，为DNA合成和细胞增殖提供原料[6], [7]。dTTP作为DNA聚合酶的底物直接掺入DNA复制中，其在DNA生物合成过程中受调节酶hTK1的控制[8]。细胞内dTTP水平的耗竭可触发“胸腺嘧啶饥饿死亡”，这是一种DNA复制缺陷且尿嘧啶掺入DNA增加的致死状态[9]。尽管hTK1并非基础DNA合成所严格必需，但它对DNA损伤后的细胞恢复仍然重要[10]。因此，hTK1在快速分裂细胞中具有重要的生理意义，在为DNA复制和修复提供胸苷方面发挥关键作用。

hTK1是一种细胞周期调节酶，在静止细胞中表达量低，但在S期和有丝分裂期间显著升高，确保为DNA复制提供充足的dTTP[11]。hTK1不仅在DNA合成过程中维持dTTP池至关重要，还支持DNA修复和损伤后的细胞恢复；其生理功能进一步由TMP能够纠正缺乏胸苷酸合成酶的细胞或在合成酶被抑制的细胞中的缺陷所证明[12]。其活性受到反馈机制的严格调控，dTTP作为关键的负效应物，有助于维持核苷酸平衡并调节核苷类似物的激活[13], [14]。hTK1还在S期之外通过提供可维持的dTTP池参与受损DNA的修复，这些dTTP用于替换DNA修复中的受损核苷酸[10]。Haveman等人[15]进一步证明，在DNA损伤细胞中耗竭hTK1会损害细胞存活，突显了其在维持细胞稳态中的作用。hTK1还具有结构动态性，表现出独特的四级结构，据报道野生型酶主要以四聚体形式存在于溶液中，而截短形式倾向于形成二聚体[4], [16]。此外，底物结合、末端区域、pH和离子强度均影响hTK1的活性和稳定性，表明其功能状态取决于质子化、寡聚化和构象柔性之间的敏感平衡[17]。这些特性使hTK1成为研究环境条件如何调节结构和功能的特别有趣的酶。

蛋白质治疗药物受到pH等环境因素引起的稳定性问题的阻碍，这些问题可能导致错误折叠、聚集和功能丧失[18], [19], [20], [21]。因此，pH是决定蛋白质结构和活性的关键因素，细胞区室维持不同的pH范围以支持大分子稳定性和功能。维持生理pH对于保持正常细胞功能和大分子结构至关重要[22]。对于hTK1而言，其催化功能依赖于精确的核苷酸结合和构象重排，即使pH的微小变化也可能显著影响结构稳定性和催化效率[23]。此外，在病理条件下，尤其是在癌症中，pH稳态经常被破坏，其中pH调节转运蛋白和酶的活性增加产生酸性细胞外环境，同时维持相对碱性的细胞内pH[24]。这种反向pH梯度通过增强细胞代谢、增殖、存活、锚定非依赖性生长和上皮-间质转化来促进肿瘤进展，从而促进侵袭和转移[25], [26]。多项研究表明hTK1活性受pH强烈影响。Prusoff和Chang早期使用艾氏腹水癌细胞的研究表明，hTK1的调控是pH依赖性的，胸苷三磷酸（dTTP）的反馈抑制在酸性条件下变得更加明显，导致酶活性降低[27]。类似地，Vázquez-Padua等人[28]报道dTTP对hTK1的抑制效应高度pH敏感，在dTTP的pKa附近（约pH 7.5）抑制最强。这些发现表明pH不仅调节hTK1激酶活性，还影响其调控机制，突显了理解pH依赖性调节的结构基础的重要性，特别是在细胞内和细胞外pH发生改变的病理环境中。尽管研究人员已广泛研究了hTK1的生物学功能和调控机制，但对其结构特性和构象动力学知之甚少。尽管已有关于胸苷激酶的pH依赖性效应的报道，但仍不清楚hTK1是否通过不同的结构机制响应酸性和碱性条件，以及这些变化如何与催化功能相关。为填补这一空白，我们检测了hTK1的构象稳定性并将其与活性相关联。为了研究这些pH依赖性结构和功能变化，本研究将实验与分子动力学模拟相结合[1], [29]。

为实现这一目标，重组hTK1被异源表达和纯化，以进行作为pH函数的结构和功能研究。采用激酶活性测定，结合圆二色谱（CD）、紫外-可见吸收、内源荧光、ANS和ThT结合、同步荧光和动态光散射（DLS）测量，以评估广泛pH范围内的结构变化。结果表明hTK1存在显著的pH依赖性构象变化，包括在极端pH值下的部分解折叠状态，并伴随催化活性。MD模拟还揭示了pH诱导的构象柔性和结构扰动的分子基础。总之，这些结果为hTK1在生理和病理相关pH范围（约6.0–8.0）内的pH调节提供了机制性理解，而模拟中使用的极端pH条件（3.0和11.0）则用于阐明去稳定化的潜在结构机制，为基于结构的药物靶向提供见解。总的来说，这些结果有助于理解hTK1受pH调节的结构机制，并可应用于理解该酶在与癌症相关的改变条件下细胞内的行为。该结构可为未来基于结构的针对异常调节的hTK1的方法提供有用指导。

章节片段

材料

带有N端6×组氨酸标签的重组TK1基因，克隆到pET28a(+)载体中，购自Biomatik?。用于驱动表达的细菌表达细胞系BL21(DE3)和用于高转化效率的DH5α购自Invitrogen（美国）。用于诱导的诱导剂异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。用于蛋白质纯化，我们使用了来自GE Healthcare（瑞典乌普萨拉）的Ni-NTA柱。

hTK1的重组表达和纯化

TK1基因成功克隆到pET28a(+)表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21 codon+表达细胞中以产生重组蛋白。鉴定了阳性转化体，使用质粒纯化试剂盒（Qiagen，德国）分离重组质粒，通过凝胶电泳进行限制性酶切消化确认，随后通过基因组测序确认。将携带TK1基因的重组pET28a(+)载体在Luria培养基中培养。

讨论

hTK1是维持DNA复制/修复所需核苷酸池的关键酶，通过胸苷补救途径实现，该途径涉及使用ATP将胸苷磷酸化为dTMP。由于hTK1在S期高表达，它作为细胞增殖的重要指标，并已在多种恶性肿瘤中成为临床相关生物标志物[5]。Ashraf等人[33]先前报道了Sa-TK，其显示出显著的pH依赖性变化。

结论与未来展望

总体而言，本研究系统研究了hTK1的pH依赖性结构和功能。综合光谱学、生物物理、酶学和分子动力学分析表明，hTK1在生理pH（8.0）下最稳定和活跃，而酸性和碱性pH值导致构象变化、暴露疏水区域、促进聚集并降低酶活性。蛋白质结构与催化功能之间的密切关系强调了。

CRediT作者贡献声明

Khadija Imtiyaz：写作–初稿，验证，方法学，调查，数据管理，概念化。Nabeel Haider：写作–初稿，可视化，软件，资源，方法学，正式分析，数据管理。Sana Saifi：写作–初稿，项目管理，方法学，调查，资金获取，正式分析。Mohd Kaif Khan：写作–初稿，软件，方法学，调查，正式分析，数据管理。Saba Noor：写作–

伦理批准

本文不包含任何作者进行的涉及动物或人类受试者的研究。

生成式AI和AI辅助技术声明（写作过程）

人工智能（AI）工具，特别是Paperpal AI，被用于润色语言、提高清晰度和增强手稿可读性。作者确认未使用任何AI工具生成原创科学内容、分析、数据解释或结论。

资金

印度医学研究委员会资助了这项工作（资助编号：ECD/adoc/2/2021–22）。沙特阿拉伯利雅得沙特国王大学正在进行的研究资助项目（ORF-2026-122）。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

MIH感谢Anusandhan国家研究基金会（ANRF）和印度医学研究委员会（ICMR）提供研究设施。作者感谢沙特阿拉伯利雅得沙特国王大学正在进行的研究资助项目（ORF-2026-122）资助这项研究。

Khadija Imtiyaz|Nabeel Haider|Sana Saifi|Mohd Kaif Khan|Saba Noor|Mohamed F. Alajmi|Faez Iqbal Khan|Nida Jamil Khan|Md. Imtaiyaz Hassan