胡椒酰胺类天然化合物DPN与血管内皮生长因子受体2失活DFG-out构象相容：计算机模拟与体外模型研究

《International Journal of Biological Macromolecules》：A piperamide natural compound is compatible with an inactive DFG-out conformation of vascular endothelial growth factor receptor-2: In silico and in vitro model study

　　

•通过虚拟筛选，DPN（一种Piper属胡椒酰胺）被鉴定为靶向血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）催化域/近膜界面（catalytic/juxtamembrane interface）的首选候选物。•计算研究表明，DPN占据横跨VEGFR2催化域和近膜域（juxtamembrane domain, JM）的调控结构域口袋（regulatory domain pocket, RDP），其结合主要由DFG环处的疏水相互作用驱动。•分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟显示，DPN与失活DFG-out/JM-out的II型样（type II–like）构象相容。•结构观察结果与体外实验一致：10 μM DPN降低VEGFR2读出指标和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）生长，但使细胞活力下降约24%。

研究背景方面，血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）是肿瘤血管生成和转移的关键跨膜受体酪氨酸激酶，在肾细胞癌、胃癌、胶质母细胞瘤和卵巢癌等癌症中为已验证的治疗靶点。已有酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKI）按稳定激酶构象分类：I型TKI结合DFG（Asp-Phe-Gly）活性构象中的ATP位点；II型TKI占据ATP口袋及相邻疏水区，稳定失活DFG-out状态；其他类型靶向别构或延伸非ATP区域，其中V型抑制剂如lenvatinib以DFG-in构象结合混合ATP/延伸口袋。tivozanib（II型；PDB 4ASE）和lenvatinib（V型；PDB 3WZD）提供参考构象。近膜（juxtamembrane, JM）区与DFG基序形成调控结构域口袋（RDP），II型抑制剂通常置换JM段（JM-out）并将激酶捕获于DFG-out构象，阻止自磷酸化。印尼生物多样性提供众多天然化合物；研究组前期通过基于结构的药物设计筛选靶向VEGFR2 JM-激酶域的配体，鉴定出来自Piper属的胡椒酰胺dehydropipernonaline（DPN）为有希望的命中物。DPN已知具有抗炎、保肝和调脂活性，但其抗血管生成特性尚未被研究。前期对接和MD分析提示DPN类似II型TKI结合RDP，并稳定保持DFG-out样状态。因此，本研究整合分子对接、结合自由能分析和MD模拟与内皮细胞实验，评估DPN是否作为优先结合并稳定失活调控构象的VEGFR2抑制剂，阐明DPN–VEGFR2相互作用的机制基础，并评估天然产物来源化合物作为VEGFR2驱动血管生成信号调节剂的更广泛潜力。研究人员开展虚拟筛选后的MD、生化与细胞实验，结论为DPN与DFG-out/JM-out的II型样构象相容；10 μM DPN降低VEGFR2读出指标并抑制HUVEC生长，但该浓度同时造成部分细胞毒性，因此不能证明DPN直接结合VEGFR2或确立其为II型TKI。其意义在于提供以MD评估配体与失活激酶构象相容性的预测框架，并将DPN定位为需进一步评估的天然产物来源候选物。

关键技术方法概括（不超过250字）：虚拟筛选与对接采用AutoDock Vina、AutoDock4及Uni-GBSA重打分，配体库来自HerbalDB；MD模拟采用GROMACS v2024.2，经CHARMM-GUI设置并采用氢质量重分配（HMR），蛋白和配体分别用AMBER ff19SB与GAFF2参数化，TIP3P水模型，0.15 M盐浓度，进行三次独立600 ns重复；结合自由能用gmx_MMPBSA，主成分分析及自由能面用MODE-TASK。细胞实验使用商业来源HUVEC；DPN分离自Piper nigrum L.果实（>95%纯度；CFN95691，ChemFaces，PRC），采用WST-1、细胞计数、qRT-PCR和Western blot。

研究结果如下。3.1 DPN与VEGFR2受体相互作用：通过600 ns全原子MD模拟，DPN在轨迹中始终与激酶结合区结合，蛋白–配体复合物保持结构完整性。3.2 DPN–DFG环距离分析：通过监测DPN与Phe¹⁰⁴⁷和Cys¹⁰⁴⁵的距离，发现DPN与二者持续邻近并呈亚纳秒波动，提示其与DFG区稳定相互作用。3.3 残基涨落与局部柔性：通过计算Cα原子的均方根涨落（root-mean-square fluctuation, RMSF），多数激酶域区域波动低至中等，DFG环呈中等波动，JM段等环区波动较高，未见大规模结构重排或配体解离。3.4 结合自由能与残基贡献：通过MM-PBSA计算，ΔG_bind在模拟过程中约?20 kcal/mol；范德华相互作用（Evdw约?50 kcal/mol）主导结合，静电作用（Eele约?10 kcal/mol）提供有利支持，极性溶剂化能（EGB约40 kcal/mol）不利但被非极性溶剂化能（ENP约?7 kcal/mol）等抵消；残基分解提示Cys¹⁰⁴⁵、Lys⁸⁶⁸、Cys⁹¹⁹和Phe⁹¹⁸等为关键稳定残基。3.5 与II型和V型TKI参考结构的构象比较：通过将DPN–VEGFR2模拟构象与tivozanib（II型；PDB 4ASE）和lenvatinib（V型；PDB 3WZD）比较，提供DFG-out与DFG-in构象基准。3.6 自由能面与主导构象状态：通过主成分分析构建自由能面（free-energy surface, FES；来自replicate 1），发现多个自由能极小值，S1（0 kcal/mol）与S2（1.82 kcal/mol）形成低能集合；该轨迹中S1约279.3 ns、S2约66.9 ns，因来自单一轨迹仅作描述性解读。3.7 FES极小值对应蛋白构象特征：通过检查S1和S2，DFG基序类似tivozanib结合的DFG-out排列而非lenvatinib的DFG-in；αC-螺旋未转为V型结构中的αC-in，JM域未呈lenvatinib结合的紧凑JM-in，而更接近II型抑制剂相关的部分置换JM-out；DPN结合态保持II型样构象。3.8 细胞活力与增殖实验：通过WST-1和细胞计数，20 μM DPN显著降低HUVEC活力；10 μM使活力降至约76%（约24%下降），1 μM约94%且不显著；增殖实验中1 μM和10 μM DPN在48 h和72 h均相对(+) VEGF抑制增殖，72 h时10 μM较(?) VEGF低26.0%（Tukey校正P=0.011），1 μM低16.4%（P=0.100），两浓度间无显著差异（P=0.430），且时间×处理交互显著。3.9 VEGFR2信号组分的转录调控：通过72 h qRT-PCR，仅10 μM DPN (+) VEGF组显著降低VEGFR2 mRNA 49.6%、PLCG1约88%、PRKCE约68%，其他处理无显著变化。3.10 VEGFR2表达与活化的蛋白水平验证：通过Western blot，10 μM DPN (+) VEGF组总VEGFR2降低92.1%、磷酸化VEGFR2（pTyr^1054/1059）降低82.3%；p-VEGFR2与总VEGFR2的比值在(+) VEGF、1 μM和10 μM分别为1.00、1.10和2.26，未显示每单位受体的磷酸化下降，提示p-VEGFR2下降与总受体下降平行，数据不显示直接抑制受体磷酸化；1 μM无显著影响，且上述变化仅见于同时降低细胞活力的浓度。

讨论部分总结：MD轨迹起始于DFG-out/JM-out对接构象，因此模拟说明DPN可被该构象容纳且不破坏该构象，而非证明DPN主动选择或诱导DFG-out；区分构象选择与被动相容需apo/holo的DFG/αC/JM分布比较、从DFG-in起始的holo轨迹、DPN单独溶剂模拟或DFG翻转增强采样。FES来自单一轨迹，仅作构象盆地图谱的定性解读；MM-PBSA能量适合排序而非绝对亲和力。细胞实验在10 μM存在部分细胞毒性，分子变化仅见于10 μM，不能排除非特异毒性；所有细胞实验重复为同一传代的技术重复，非独立生物学重复；未设阳性对照、未做剂量–反应（IC₅₀）、无选择性对照，直接结合与抑制VEGFR2仍未获证明。后续需激酶活性IC₅₀、以tivozanib为基准、热位移/SPR/ITC或CETSA、Cys¹⁰⁴⁵和Phe¹⁰⁴⁷突变、广谱激酶谱及ADMET和药代动力学评价。研究结论翻译如下：总之，计算和生化结果支持以下解释：DPN以与II型抑制剂通常靶向的DFG-out区域发生部分或完全结合相一致的方式与VEGFR2相互作用。DPN处理的内皮细胞中VEGFR2丰度和磷酸化降低与这种相互作用一致，VEGF诱导的增殖降低也一致，但这些现象是在同时降低细胞活力的浓度下观察到，因此不能特异性归因于VEGFR2抑制。数据不能确立DPN为II型TKI或直接结合VEGFR2：模拟显示DPN与DFG-out样口袋相容，细胞数据显示在部分细胞毒性浓度下VEGFR2信号读出降低。未来包括激酶活性实验、热位移分析和晶体学结构测定等研究，对于阐明DPN精确抑制机制和评估其作为抗血管生成药物发现先导化合物的适用性很重要。尽管如此，MD模拟和细胞数据相互一致，使DPN成为进一步评估作为VEGFR2信号调节剂的天然产物来源候选化合物。