包载槲皮素和层状双氢氧化物的润滑水凝胶微球通过FOXP1-P53-P21轴改善年龄相关性骨关节炎

《Chemical Engineering Journal》：Lubricating hydrogel microspheres encapsulated with quercetin and layered double hydroxide ameliorate age-related osteoarthritis via FOXP1-P53-P21 axis

　　•LDH@Q@HM 具有抗软骨细胞衰老、抗巨噬细胞焦亡和关节润滑的协同治疗效果，可用于年龄相关性OA。
•FOXP1 是软骨细胞衰老的重要调控因子，为年龄相关性OA提供了潜在的治疗靶点。
•LDH@Q@HM 通过 FOXP1-P53-P21 信号通路减轻软骨细胞衰老。

引言

骨关节炎（OA）是一种与年龄相关的退行性疾病，以关节软骨退行性变、滑膜炎、骨赘形成和软骨下骨重塑为特征[1]，[2]。其主要症状包括关节疼痛、肿胀和活动受限[3]，[4]，[5]。随着人口老龄化，全球OA患者数量不断增加[6]。一项流行病学调查估计，2020年全球OA患者人数约为5.95亿，预计到2025年膝OA患者人数将增加74.9%[7]。目前，OA的治疗主要采用阶梯式治疗方案，包括健康管理、物理治疗、药物治疗等[8]，[9]。这些治疗能在一定程度上缓解患者的疼痛症状，但无法阻止OA的进展。对于晚期OA患者，关节置换手术是唯一可用的治疗方法[10]。因此，我们需要加强对年龄相关性OA新靶点的探索，并开发新的治疗方法。

软骨细胞衰老、巨噬细胞焦亡和滑液润滑功能下降是年龄相关性OA的重要特征[11]，[12]。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，在细胞外基质（ECM）的合成和维持中发挥重要作用[13]。软骨细胞的衰老是关节退行性变的核心环节[14]，[15]。衰老的软骨细胞表现出细胞周期停滞、氧化应激水平升高，并伴随衰老相关分泌表型（SASP）的释放，如IL-1β、TNF-α、趋化因子和基质金属蛋白酶（MMPs）[16]，[17]。SASP中的促炎细胞因子可促进局部炎症微环境的形成，导致活性氧（ROS）过度积累，并干扰周围正常软骨细胞的代谢和功能，造成细胞衰老的恶性循环[18]，[19]。SASP中的趋化因子如CCL2可招募巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞，放大炎症级联反应[20]。巨噬细胞在OA的发病机制中发挥重要作用，其功能失衡、铁死亡和焦亡可导致持续炎症反应和组织损伤[21]，[22]。焦亡是一种程序性且伴有炎症的细胞死亡途径，伴随炎症因子的快速大量释放，可驱动滑膜炎症和软骨破坏，是促进OA持续进展的重要机制[23]。在OA的炎症和氧化应激环境下，巨噬细胞中的NOD样受体热蛋白结构域3（NLRP3）炎症小体被激活，裂解pro-Caspase-1产生有活性的Caspase-1。活化的Caspase-1可进一步促进gasdermin D的N端片段（GSDMD-N）、IL-1β和IL-18的生成[24]，[25]。GSDMD-N可在细胞膜上形成孔道，导致细胞破裂并释放细胞内容物和炎症因子[26]。焦亡的巨噬细胞不仅是炎症细胞因子的主要来源，还通过招募额外的免疫细胞和促进基质降解酶的产生来重塑关节免疫微环境。因此，巨噬细胞焦亡建立了炎症和组织损伤之间的恶性循环，导致OA持续进展。鉴于其在驱动炎症放大和关节退变中的核心作用，靶向巨噬细胞焦亡已成为OA的有前途的治疗策略[27]，[28]。滑液由滑膜分泌，在关节间隙中提供润滑和缓冲作用[29]。衰老导致滑液分泌减少和质量下降，润滑效率减弱，随后加速软骨磨损和OA的发生[30]，[31]。因此，开发一种整合延缓软骨细胞衰老、抑制巨噬细胞焦亡和增强关节润滑的协同治疗策略，有望延缓年龄相关性OA的进展。

叉头框蛋白P1（FOXP1）是FOX转录因子蛋白家族的成员，在调节胚胎发育、免疫稳态和细胞分化中发挥重要作用[32]，[33]，[34]。新证据也强调了它在调节细胞衰老中的作用。FOXP1已被确定为调节卵巢衰老的重要因子[35]。在衰老的间充质干细胞中，FOXP1的下调导致衰老标志物P16的表达显著增加[36]。然而，FOXP1是否能调节软骨细胞衰老仍不清楚。本文旨在探讨FOXP1在软骨细胞衰老和年龄相关性OA中的作用。

鉴于FOXP1在衰老调控中的潜在作用，鉴定能够恢复FOXP1表达的治疗药物可能代表治疗年龄相关性OA的有前途的策略。值得注意的是，先前的研究报道槲皮素可以特异性上调FOXP1并改善卵巢衰老[35]。槲皮素是一种广泛存在于蔬菜和水果中的天然黄酮类化合物，由于其强效的抗氧化、抗炎和抗衰老特性，作为一种有前途的衰老治疗药物受到广泛关注[37]，[38]，[39]。槲皮素已在多种肌肉骨骼衰老疾病中显示出治疗功效，包括OA、椎间盘退变和肌腱衰老[40]，[41]，[42]，[43]。越来越多的证据表明，槲皮素可以通过调节关键的衰老相关信号通路来缓解细胞衰老和年龄相关组织退变，包括P53-P21轴和SASP相关的炎症反应[44]，[45]。重要的是，生物信息学分析将P53/P21轴确定为年龄相关性OA的关键分子特征。因此，考虑到其已证实的抗衰老活性、调节FOXP1表达的能力以及其与P53/P21信号通路的机制相关性，选择槲皮素作为潜在治疗药物进行进一步研究。槲皮素表现出良好的生物安全性和转化潜力。然而，生物利用度差、溶解度低和水中稳定性差等问题限制了槲皮素的应用[46]。

层状双氢氧化物（LDH）是一种具有独特层状结构的无机材料[47]。LDH具有优异的生物相容性和可降解性，已被广泛用作生物医学领域的新型药物递送载体[48]。先前的研究发现LDH可以调节巨噬细胞极化并增强软骨细胞中ECM的分泌[47]，[48]。在本研究中，我们使用LDH来分散槲皮素，不仅显著提高了槲皮素的生物利用度，还进一步改善了OA的治疗效果。由于软骨缺乏血管，药物难以到达软骨发挥保护作用。关节内注射可以将药物直接递送至病变部位，提高药物的生物利用度和功效。为了更好地适应关节内注射，我们使用甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱（MPC）的混合物制备微球，用于封装负载槲皮素的LDH。MPC是一种含有甲基丙烯酸酯和磷酸胆碱基团的有机化合物。磷酸胆碱基团是一种两性离子基团，可以与水分子结合形成稳定致密的水合层，从而进一步降低材料表面的摩擦系数[49]，[50]。此外，水合层可以显著减少蛋白质吸附和细胞粘附，增强微球的生物相容性[51]，[52]。

为了解决年龄相关性OA的挑战，我们开发了一种基于HAMA和MPC的水凝胶微球，在其内部封装负载槲皮素的LDH（图1）。与传统水凝胶相比，水凝胶微球具有体积小、流动性强和润滑性能优异的优点，更适合关节内注射[53]。我们对LDH@Q@HM复合水凝胶微球的理化性质进行了深入研究，并在体外细胞模型和衰老小鼠模型中评估了其治疗效果。LDH@Q@HM实现了协同效应，包括延缓软骨细胞衰老、保护软骨ECM和抑制巨噬细胞焦亡。通过网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和免疫共沉淀等方法探索了复合微球治疗年龄相关性OA的潜在机制。总之，我们的研究结果表明LDH@Q@HM在治疗年龄相关性OA方面显示出良好的治疗前景。

片段部分

材料/试剂

槲皮素和Cy5购自Med Chem Express（中国上海）。HAMA购自Engineering for Life（中国）。MPC购自Macklin（中国上海）。2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）购自Solarbio。LPS、ATP和过氧化氢（H2O2）购自Sigma-Aldrich。用于细胞培养的DMEM、胎牛血清、青霉素和链霉素以及0.25%胰蛋白酶购自Gibco。RAW264.7细胞系购自Procell Biotechnology。

LDH@Q@HM微球的合成

年龄相关性OA的ATAC-seq和网络药理学分析

为了探索年龄相关性骨关节炎中软骨细胞异质性的表观遗传调控机制，我们基于GEO数据库进行了ATAC-seq分析。对照组选择两组健康年轻人的软骨ATAC-seq数据，年龄相关性OA组选择三组老年人的软骨ATAC-seq数据（75岁男性；86岁女性；65岁女性）。在对照组和年龄相关性OA组中，平均分别获得51,306和69,099

讨论

本研究表明，LDH@Q@HM通过减轻软骨细胞衰老和巨噬细胞焦亡，有效缓解年龄相关性OA的进展。越来越多的证据表明，在OA进展过程中，巨噬细胞焦亡和软骨细胞稳态密切相关[67]。焦亡的巨噬细胞释放多种促炎细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs），包括IL-1β和IL-18，从而放大滑膜炎症并加速

结论

在本研究中，开发了一种用于年龄相关性OA治疗的生物活性LDH@Q@HM水凝胶微球，具有关节润滑和递送LDH及槲皮素的多重功能。FOXP1-P53-P21轴被发现是调节年龄相关性OA的关键通路。LDH@Q@HM可以通过FOXP1/P53/P21信号通路有效延缓软骨细胞衰老。此外，复合微球在降低细胞内氧化应激方面也表现出优异的治疗效果，

CRediT作者贡献声明

Xiangdong Wen：写作——原稿，可视化，正式分析，数据管理。Jinquan Cui：写作——原稿，验证，软件，概念化。Xingchen Wei：写作——原稿，验证，方法学，调查。Guojiang Zhang：正式分析，数据管理。Yichen Zhang：可视化，概念化。Guangxian Liu：方法学。Hengzhen Li：软件，概念化。Qi Meng：调查，正式分析。Dengju Li：方法学，概念化。

伦理批准与参与同意

所有程序均按照山东第一医科大学附属山东省立医院伦理委员会批准的方案进行（编号2024-680，中国山东）。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本论文所报告的工作。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（82102600和82272485）和山东省自然科学基金（ZR2025MS1391）的资助。图形摘要和图1的草稿使用BioRender.com创建。

Xiangdong Wen|Jinquan Cui|Xingchen Wei|Guojiang Zhang|Yichen Zhang|Guangxian Liu|Hengzhen Li|Qi Meng|Dengju Li|Changxing Liu|Rongrong Li|Zhihan An|Shui Sun|Yawei Sun|Senbo An