《International Dental Journal》：Lymphangiogenesis-Related Prognostic Genes in Oral Squamous Cell Carcinoma
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摘要
背景与目的：淋巴管生成（Lymphangiogenesis, LYM）显著影响口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）的发生发展，因此有必要鉴定与之相关的预后基因以改善临床管理。
方法：研究人员
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摘要
背景与目的：淋巴管生成（Lymphangiogenesis, LYM）显著影响口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）的发生发展，因此有必要鉴定与之相关的预后基因以改善临床管理。
方法：研究人员分析了差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）与淋巴管生成相关基因（LYM-related genes, LYM-RGs）。通过回归分析筛选预后基因，并构建风险模型。随后进行了功能、免疫及药物分析，并采用单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）进行验证。
结果：IL17F、CCL26、OLR1、Kelch样家族成员6（Kelch-like family member 6, KLHL6）和IL17A被鉴定为预后基因。所构建的风险模型显示，高风险组患者的生存率较低。此外，高风险组与低风险组在13种免疫细胞的浸润水平上存在差异。在药物预测分析中，地西他滨（decitabine）和二氧化钛（titanium dioxide）被发现可同时靶向IL17A和OLR1。最后，通过单细胞RNA测序水平分析，巨噬细胞被确定为关键细胞，并包含7种分化状态。值得注意的是，OLR1在巨噬细胞分化阶段的总体表达水平相对较高，且呈现先下降后上升的趋势。
结论：IL17F、CCL26、OLR1、KLHL6和IL17A被鉴定为预后基因，为OSCC患者的诊断和预后提供了新的视角。
临床意义：5基因标志物为OSCC患者的预后分层提供了一种新型工具，有助于个体化风险评估。此外，所鉴定的基因及其相关的免疫特征为未来治疗开发提供了潜在靶点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是起源于口腔黏膜衬里的恶性肿瘤，主要累及舌、唇、颊黏膜、牙龈及硬腭等部位，约占口腔恶性肿瘤的90%。该侵袭性癌的发病机制复杂，涉及基因组不稳定和表观遗传改变，并受吸烟、饮酒及高危型人乳头瘤病毒感染等可调控风险因素影响。全球范围内OSCC的发病率和死亡率呈上升趋势，每年新增病例超过37万例，死亡约17万例。临床上，30%至50%的OSCC患者发生转移性淋巴结受累，导致5年生存率低于50%，复发率介于18%至76%之间，总体预后不佳。尽管临床治疗手段不断进步，但由于解剖结构复杂、治疗局限性及常规疗法相关的严重毒副作用，OSCC管理的总体疗效仍不理想。
转移是癌症患者预后不良的主要决定因素，常通过淋巴系统发生。淋巴管生成（lymphangiogenesis, LYM）即新生淋巴管的形成，是肿瘤细胞进入淋巴管的关键步骤。肿瘤通过分泌血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C, VEGF-C）等淋巴管生成诱导因子促进LYM及后续转移。肿瘤相关LYM已成为阻止癌症进展的关键治疗靶点。值得注意的是，肿瘤组织内淋巴管密度与OSCC患者的不良预后相关。研究显示，在淋巴结阳性的OSCC中，侵袭性肿瘤前沿的VEGF-C免疫反应性升高，提示VEGF-C驱动的LYM与癌症侵袭性增强之间存在机制联系。然而，目前缺乏基于LYM相关基因的系统性预后评估工具，亟需鉴定相关预后基因以改善OSCC的临床管理。
二、研究设计与技术方法
研究人员从UCSC Xena数据库获取TCGA-OSCC数据集作为训练集，包含339例OSCC肿瘤样本和32例正常组织样本；从GEO数据库获取GSE41613（平台GPL570，97例含完整生存数据的组织样本）作为验证集；从GeneCards数据库获取577个LYM相关基因；从GEO数据库获取包含6例OSCC肿瘤组织样本的scRNA-seq数据集GSE172577（平台GPL24676）。
主要关键技术方法包括：利用DESeq2包进行差异表达分析；通过单因素Cox回归分析筛选与生存相关的候选基因，并采用随机森林（random forest, RF）模型鉴定预后基因；构建风险模型并在验证集中验证；利用neuralnet包构建深度神经网络（deep neural network, DNN）分类模型；进行GO和KEGG富集分析、基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；评估28种免疫细胞浸润水平及免疫检查点（immune checkpoints, ICs）表达差异，计算肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）；预测靶向预后基因的microRNAs（miRNAs）、长链非编码RNAs（lncRNAs）及转录因子（transcription factors, TFs）并构建调控网络；通过DSigDB预测药物并进行分子对接；利用Seurat包进行单细胞RNA测序分析，包括细胞聚类、细胞通讯分析（CellChat）及拟时序分析（monocle）；采用RT-qPCR和免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）验证预后基因表达；构建KLHL6过表达细胞模型并进行CCK-8、Transwell迁移和侵袭实验。
三、研究结果
176个候选基因的获得：在TCGA-OSCC肿瘤与正常样本中鉴定出4747个DEGs，其中2081个上调、2666个下调。将4747个DEGs与577个LYM-RGs取交集，获得176个候选基因。
候选基因参与多条通路：候选基因显著富集了2023个GO条目（1848个生物学过程、55个细胞组分、120个分子功能）和101条KEGG通路，如PI3K/Akt信号通路。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络中，IL6和FN1等基因与其他基因的相互作用最多。
5个预后基因的识别：通过单因素Cox回归分析，6个基因（PLAU、IL17F、CCL26、OLR1、KLHL6和IL17A）与OSCC预后显著相关，其中5个基因通过比例风险（proportional hazards, PH）假设检验。随机森林模型将IL17F、CCL26、OLR1、KLHL6和IL17A确定为预后基因，其中IL17A的重要性最高。RT-qPCR和IHC验证显示，IL17F、IL17A和KLHL6在OSCC中显著下调，而CCL26和OLR1显著上调。KLHL6过表达可抑制Cal-27和SAS细胞系的增殖、迁移和侵袭能力。
风险模型具有良好的预测准确性：在TCGA-OSCC中，339例患者根据风险评分最佳截断值（60.54391）分为高风险组（HRG，n=127）和低风险组（LRG，n=212）；在GSE41613中，107例患者按截断值40.3187分为HRG（n=67）和LRG（n=30）。Kaplan-Meier曲线显示HRG患者生存率显著较差。ROC曲线在1、3、5年的AUC值均大于0.6。DNN分类模型在TCGA-OSCC中AUC为0.701，在GSE41613中为0.693。
列线图具有优越的预测准确性：风险评分、N分期、T分期及分期与OSCC患者预后显著相关，其中风险评分被确定为独立预后因素。基于5个预后基因构建的列线图校准曲线与理想曲线高度吻合，ROC曲线AUC值在1、3、5年均高于0.6。
HRG与LRG之间的富集通路和免疫微环境存在差异：35条KEGG通路在两组间显著富集，前5条通路（如原发性免疫缺陷）在LRG中显著富集。13种免疫细胞浸润水平在两组间存在显著差异，且均在LRG中浸润水平更高。活化B细胞与风险评分显著负相关（cor=?0.31）。13个免疫检查点（如BTLA和CD200R1）在两组间表达差异显著。HRG与LRG的TMB评分差异显著（P=0.0047）。HRG中突变频率最高的基因为FAT1（29%），LRG中为CDKN2A（25%）。
预后基因受多个分子同时调控：预测了靶向CCL26、IL17A、IL17F、KLHL6和OLR1的miRNAs，筛选出76个目标评分≥80的miRNAs，并预测了240个lncRNAs。构建了lncRNA-miRNA-mRNA网络（如NORAD-hsa-miR-129-1-3p-IL17A）和TF-mRNA调控网络，其中FOXC1共同靶向CCL26、IL17A、KLHL6和OLR1，JUN共同靶向CCL26、IL17F、KLHL6和OLR1。
预后基因与药物具有良好的结合能力：34种药物的IC50值在HRG与LRG间差异显著。药物预测显示地西他滨和二氧化钛同时靶向IL17A和OLR1。分子对接显示IL17A与地西他滨的结合自由能为?6.9 kcal/mol，OLR1与二氧化钛的结合自由能为?6.7 kcal/mol。
巨噬细胞对OSCC的发生发展至关重要：质控后56,624个细胞用于分析，经UMAP聚类鉴定出14个细胞簇，注释为7种细胞类型（上皮细胞、T细胞、巨噬细胞、内皮细胞、B细胞、肌成纤维细胞和肥大细胞）。巨噬细胞被确定为关键细胞，包含7种分化状态。OLR1在巨噬细胞分化阶段的总体表达水平相对较高，且呈现先下降后上升的趋势。
四、讨论与结论
本研究通过整合差异表达分析、淋巴管生成相关基因筛选、回归建模及单细胞验证，系统鉴定了IL17F、CCL26、OLR1、KLHL6和IL17A五个OSCC预后基因。5基因标志物为OSCC患者的预后分层提供了新型工具，有助于个体化风险评估。免疫微环境分析揭示了高风险组与低风险组在免疫细胞浸润、免疫检查点表达及突变谱方面的显著差异，为免疫治疗方案的制定提供了依据。药物预测与分子对接结果为靶向治疗提供了潜在候选药物。巨噬细胞被确定为关键细胞类型，OLR1在巨噬细胞分化中的动态表达模式提示其在OSCC进展中的潜在作用。这些发现为OSCC患者的诊断、预后评估及个体化治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。
五、研究结论
IL17F、CCL26、OLR1、KLHL6和IL17A被鉴定为预后基因，为OSCC患者的诊断和预后提供了新的视角。5基因标志物为OSCC患者的预后分层提供了一种新型工具，有助于个体化风险评估。此外，所鉴定的基因及其相关的免疫特征为未来治疗开发提供了潜在靶点。
