《Genes & Diseases》：KPNB1 protects SIX2 from TRIM27-dependent ubiquitination and degradation to facilitate clear cell renal cell carcinoma
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透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾癌中最常见的亚型，具有高度侵袭性和内在治疗耐药性。SIX2是在肾脏发育过程中维持后肾祖细胞干性所必需的一种转录因子。值得注意的是，已在ccRCC中观察到SIX2的
透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾癌中最常见的亚型，具有高度侵袭性和内在治疗耐药性。SIX2是在肾脏发育过程中维持后肾祖细胞干性所必需的一种转录因子。值得注意的是，已在ccRCC中观察到SIX2的异常再激活，然而，其致癌功能的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员证明SIX2在ccRCC组织中显著上调并主要定位于细胞核，在体内和体外均驱动肿瘤进展。机制上，核输入蛋白KPNB1与SIX2的107–114区域结合，与E3泛素连接酶TRIM27竞争该重叠界面。这种竞争性相互作用不仅促进SIX2的核积累，还遮蔽赖氨酸114（lysine 114，K114），从而阻止TRIM27介导的泛素化及随后的降解。综上，本研究揭示了一种KPNB1与TRIM27调节SIX2稳定性的竞争性调控机制，并确定了KPNB1–SIX2界面可作为ccRCC的潜在治疗靶点。
**研究背景与科学问题**
肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）起源于肾小管上皮，约占所有原发性肾脏恶性肿瘤的85%。其中，透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常见的组织病理学亚型，占RCC病例的60%–85%，以高转移潜力、频繁的术后复发以及对常规放疗和化疗的内在耐药为特征。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，晚期ccRCC患者的临床预后仍然较差，迫切需要阐明驱动ccRCC发病的分子机制并识别新的治疗靶点。
SIX2是一个同源结构域转录因子，在哺乳动物肾脏发育中通过定义和调节自我更新的多能肾单位祖细胞群体发挥关键作用。近年研究发现，SIX2在肝癌、乳腺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中通过转录和表观遗传抑制E-钙黏蛋白（E-cadherin）促进侵袭转移，并通过激活SOX2–NANOG轴增强干性。在ccRCC中，SIX2显著上调，且高表达与患者较差的总生存期相关。然而，SIX2的上游调控机制，尤其是其翻译后调控机制，在很大程度上仍然未知。
核质转运与细胞稳态密切相关，其失调影响肿瘤发生。KPNB1作为importin-β家族成员，介导蛋白货物入核，在多种癌症中经常上调以支持恶性进展。TRIM27是TRIM家族E3泛素连接酶，催化底物泛素化和蛋白酶体降解，在多种癌症中过表达并与不良预后相关。生物信息学分析提示SIX2可能与KPNB1和TRIM27均存在潜在相互作用。这些发现促使研究人员探究KPNB1和TRIM27是否汇聚于SIX2，从而在ccRCC中调节其核定位和蛋白稳定性。
**研究内容与主要结论**
研究人员首先通过免疫组化（immunohistochemistry，IHC）分析了59对ccRCC组织及其配对癌旁正常组织，证实SIX2在ccRCC组织中显著上调，并利用TCGA-KIRC数据库分析发现高SIX2表达与较差的总生存期（overall survival，OS）和无病生存期（disease-free survival，DFS）显著相关。功能实验表明，敲低SIX2显著抑制786-O细胞的增殖和迁移并促进凋亡，且SIX2敲低在异种移植小鼠模型中显著抑制肿瘤生长。亚细胞定位分析显示SIX2在ccRCC细胞中主要定位于细胞核。通过生物信息学预测结合实验验证，研究人员鉴定了SIX2两个功能性核定位信号（nuclear localization signals，NLS），分别位于SIX结构域（氨基酸107–114）和同源盒结构域（氨基酸132–157）。
通过BioGRID数据库筛选和质谱分析，研究人员鉴定出KPNB1为SIX2的潜在核转运受体。Co-IP实验证实KPNB1与SIX2直接结合，结合区域定位在SIX2的107–114氨基酸区域。KPNB1抑制剂Importazole（IPZ）处理或siRNA敲低KPNB1均导致SIX2核定位减少，同时伴随SIX2蛋白水平下降，而mRNA水平不变，提示KPNB1在翻译后水平调控SIX2稳定性。进一步研究表明，SIX2主要通过泛素-蛋白酶体系统降解，KPNB1抑制显著增强SIX2的多聚泛素化水平。
利用UbiBrowser数据库筛选，研究人员鉴定出TRIM27为SIX2的候选E3泛素连接酶，分子对接模拟和Co-IP实验验证了二者的相互作用。功能实验表明，TRIM27敲低增加SIX2蛋白水平，而TRIM27过表达以剂量依赖方式降低SIX2蛋白水平，且这一效应可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转。泛素化实验证明TRIM27主要通过K48连接的多聚泛素链促进SIX2降解。进一步研究发现，KPNB1与TRIM27竞争结合SIX2的107–114区域，KPNB1过表达剂量依赖性地减弱TRIM27与SIX2的相互作用。通过点突变实验，研究人员确定K114为SIX2的主要泛素化位点，KPNB1结合通过空间遮蔽K114阻止TRIM27介导的泛素化。TCGA-KIRC队列的生存分析显示，SIX2高表达联合TRIM27高表达的患者预后最差，而SIX2高表达联合KPNB1高表达的患者预后相对较好，这与竞争性屏蔽模型一致。
**主要技术方法**
该研究使用了多种关键实验技术：利用人肾癌细胞系786-O、A498、正常肾细胞HK-2和HEK293T细胞（其中786-O和A498购自武汉普诺赛生命科技有限公司并经STR鉴定，HK-2和HEK293T购自ATCC）进行体外实验；采用组织芯片（tissue microarray，TMA）和IHC染色分析临床样本；通过质谱分析和BioGRID数据库预测蛋白相互作用；运用Co-IP、免疫荧光（immunofluorescence，IF）、蛋白免疫印迹（Western blot，WB）验证蛋白互作与定位；利用泛素化实验检测蛋白泛素化水平；采用CCK-8增殖实验、伤口愈合实验、流式细胞术凋亡分析进行功能研究；通过慢病毒感染构建稳定敲低细胞系；利用BALB/c裸鼠（购自北京维通利华）建立异种移植肿瘤模型进行体内实验；使用GEPIA和KM Plotter数据库进行生物信息学分析；通过点突变技术鉴定泛素化位点。
**研究结果**
**SIX2在ccRCC组织中高表达并与不良预后相关。** 通过IHC染色分析59对ccRCC组织及其配对癌旁组织，研究人员发现SIX2在ccRCC组织中表达水平显著升高（H-score：11.14 ± 1.96 vs 1.27 ± 1.26，P < 0.001）。TCGA-KIRC数据分析显示，高SIX2表达组患者的OS（P = 0.00057）和DFS（P = 0.00018）显著短于低表达组，表明SIX2可作为ccRCC预后不良的标志物。
**敲低SIX2抑制ccRCC细胞增殖和迁移并促进凋亡。** 在786-O细胞中稳定敲低SIX2后，CCK-8实验显示细胞增殖能力显著下降，伤口愈合实验显示细胞迁移能力受损，流式细胞术凋亡分析显示凋亡率显著升高。WB分析表明，SIX2过表达下调促凋亡蛋白Bax并上调抗凋亡蛋白Bcl-2，而SIX2敲低则产生相反效应，表明SIX2通过增强细胞存活促进ccRCC恶性进展。
**SIX2敲低在体内抑制肿瘤生长。** 将稳定敲低SIX2的786-O细胞皮下注射至裸鼠腋窝区域，三周后处死小鼠并收取肿瘤。与对照组相比，SIX2敲低组肿瘤体积和重量均显著降低。IHC分析显示敲低组肿瘤组织中SIX2和增殖标志物Ki-67的表达水平均显著下降，证实SIX2在体内促进ccRCC肿瘤生长。
**SIX2在肾癌细胞中主要定位于细胞核。** 临床组织IHC染色显示SIX2阳性信号在癌细胞核内显著增强，而癌旁正常组织核阳性信号明显较少。亚细胞分级分离实验和免疫荧光分析均证实SIX2在786-O和A498细胞中主要定位于细胞核。通过生物信息学预测和缺失突变实验，研究人员鉴定出两个功能性NLS（氨基酸107–114和132–157），缺失任一NLS均损害SIX2核定位、转录活性以及对E-cadherin的抑制功能。
**KPNB1与SIX2相互作用并介导其核定位。** 通过BioGRID数据库和质谱分析鉴定KPNB1为SIX2的相互作用蛋白。Co-IP实验证实KPNB1与SIX2结合，结合区域位于SIX2的107–114氨基酸区域。IPZ处理KPNB1或siRNA敲低KPNB1均显著降低SIX2的核定位和蛋白水平，而SIX2 mRNA水平不变，表明KPNB1在翻译后水平调控SIX2稳定性。泛素化实验显示，抑制KPNB1显著增强SIX2的多聚泛素化，提示KPNB1通过抑制泛素介导的蛋白酶体降解来稳定SIX2。
**TRIM27作为E3泛素连接酶促进SIX2的K48连接泛素化和降解。** 通过UbiBrowser数据库筛选出TRIM27为SIX2的候选E3连接酶（置信度评分0.834）。Co-IP实验验证了TRIM27与SIX2的相互作用。TRIM27敲低增加SIX2蛋白水平，而过表达则以剂量依赖方式降低SIX2蛋白水平。MG132处理可逆转TRIM27诱导的SIX2降解。泛素化实验表明，TRIM27主要通过K48连接的多聚泛素链促进SIX2降解。
**KPNB1通过竞争TRIM27结合位点拮抗SIX2降解。** 内源性Co-IP实验证明TRIM27、SIX2和KPNB1在ccRCC细胞中形成三元复合物。同时敲低TRIM27和KPNB1可基本恢复单独敲低KPNB1引起的SIX2蛋白水平下降。截短突变体pull-down实验表明TRIM27与KPNB1结合SIX2的同一区域（107–114氨基酸）。KPNB1过表达剂量依赖性地减少TRIM27的pull-down量。点突变实验确定K114为SIX2的主要泛素化位点，因为K114突变显著削弱SIX2的泛素化。TCGA-KIRC队列分析显示SIX2高/TRIM27高亚组预后最差，SIX2高/KPNB1高亚组预后相对较好，与竞争性屏蔽模型一致。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该研究进一步证实了SIX2在ccRCC中的异常激活。与以往在乳腺癌中发现TRIM21调控SIX2降解不同，本研究发现TRIM27是ccRCC中介导SIX2泛素化的主要E3连接酶，TRIM21过表达对SIX2蛋白丰度无显著影响，提示SIX2的E3连接酶具有组织选择性。KPNB1抑制剂如IPZ已在多种临床前模型中显示出抗癌效果，但缺乏在肾癌模型中的直接证据。本研究为KPNB1抑制在ccRCC中的优先应用提供了机制基础。此外，研究人员提出将KPNB1抑制剂与舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）联用可能产生协同治疗效应，并讨论了PROTAC（proteolysis-targeting chimera）技术作为直接降解SIX2的潜在策略。
研究结论翻译如下：总之，研究人员的发现确立了SIX2作为ccRCC中关键致癌驱动因子的地位。研究人员证明KPNB1介导的核输入是ccRCC细胞中SIX2异常核积累的原因。在机制上，KPNB1与E3连接酶TRIM27竞争性结合SIX2的107–114区域，其中KPNB1的结合在物理上遮蔽赖氨酸114（K114），从而阻碍TRIM27介导的泛素化。这种竞争性抑制因此稳定SIX2并增强其促肿瘤活性。综上所述，该研究揭示了调控SIX2稳定性的KPNB1–TRIM27调控轴，并为靶向该通路治疗ccRCC提供了机制基础。
