c-Abl–Wnt正反馈信号环路驱动肾小管上皮细胞促炎性重编程及小鼠肾纤维化发生

《Genes & Diseases》：Reciprocal c-Abl–Wnt signaling drives pro-inflammatory reprogramming of tubular epithelial cells and renal fibrogenesis in mice

　　

摘要 肾纤维化是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）常见的病理表现。上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）在肾纤维化过程中发挥重要作用。本研究发现，c-Abl（由ABL proto-oncogene 1编码）在肾纤维化组织的肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells，TECs）中表达富集。肾小管上皮细胞特异性敲除c-Abl通过抑制EMT及炎性浸润，减轻了肾纤维化的组织学及分子学特征。体外实验中，TECs中c-Abl过表达可促进EMT，并伴随Wnt/β-catenin信号通路激活；而激活的Wnt/β-catenin信号通路反过来又可上调c-Abl表达，从而形成正反馈环路。研究人员进一步发现，在肾纤维化过程中，一群TECs经历了部分EMT程序，导致Ksp阳性细胞中PDGFRα的表达。Ksp+PDGFRα+细胞可能与巨噬细胞募集及炎性微环境建立相关，表现为趋化因子和炎性介质表达升高。TECs中敲除c-Abl可减少Ksp+PDGFRα+细胞数量并延缓EMT进程。在纤维化小鼠模型中，c-Abl抑制剂尼洛替尼（nilotinib）和GNF5可减轻组织学纤维化、EMT相关标志物改变及炎性浸润。综上，研究结果表明，c-Abl依赖的Wnt/β-catenin信号激活及Ksp+PDGFRα+促炎性TECs通过部分EMT驱动肾纤维化，为慢性肾脏病的发病机制提供了新见解，并揭示了新的治疗靶点。

一、研究背景与科学问题

肾纤维化是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）最常见的病理表现。随着肾纤维化的进展，CKD患者的肾功能可能进行性下降，最终发展为终末期肾病。目前可用的治疗手段无法阻止或逆转肾功能下降，这凸显了深入理解CKD及肾纤维化发病机制的迫切需求。大量研究表明，上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）在肾纤维化中发挥重要作用。例如，在肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells，TECs）中特异性敲除Twist1和Snail1这两个经典的EMT转录因子，可有效阻断EMT发生、改善肾小管功能并缓解间质纤维化。然而，EMT如何发生以及参与EMT的TECs如何启动间质纤维化，在很大程度上仍不清楚。

肾损伤可诱导转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）信号通路激活，这是CKD和纤维化进程的关键驱动因素。在成年肾损伤中，受损TECs是TGF-β1的重要来源。尽管已证实TECs表达和分泌的TGF-β1有助于EMT及最终的间质纤维化，但TGF-β1的确切肾小管细胞来源群体仍不清楚。

c-Abl（由ABL proto-oncogene 1编码）是Abelson家族非受体酪氨酸激酶成员，参与非经典TGF-β信号转导，并在多种细胞过程中发挥基础功能。c-Abl还以不依赖Smad3的方式介导TGF-β的促纤维化效应。伊马替尼（imatinib）作为一种c-Abl抑制剂，可在细胞培养和肺纤维化小鼠模型中减弱TGF-β的纤维化效应。在体内成纤维细胞及大鼠实验性单侧梗阻性肾病中，c-Abl均被激活。总体而言，c-Abl在纤维化器官中表达或活性上调，但其潜在分子机制仍不清楚。研究人员前期研究揭示，在肾间质细胞中，c-Abl通过调控RACK1在黏着斑处的蛋白稳定性来维持其功能，进而促进应力纤维组装和肌成纤维细胞分化，导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）表达和沉积增加，从而促进肾纤维化的发生和进展。鉴于肾小管功能在肾纤维化中的关键作用，研究人员进一步探索了c-Abl在受损肾TECs中的调控机制。

二、研究内容与主要结论

本研究首次直接将c-Abl与肾纤维化过程中TEC损伤的发病机制联系起来。研究显示，c-Abl在小鼠和人类纤维化肾脏的TECs中被激活并过表达。TECs中敲除c-Abl可有效改善EMT和间质纤维化。机制上，c-Abl激活Wnt/β-catenin信号通路，并形成c-Abl–Wnt相互激活的正反馈环路，从而加重肾纤维化。此外，TECs中c-Abl激活导致Ksp⁺PDGFRα⁺促炎性细胞的形成，这些细胞产生并分泌趋化因子和炎性因子，有助于巨噬细胞募集和间质细胞转分化。因此，靶向TECs中的c-Abl可能是治疗肾纤维化的实用方法。该论文发表在《Genes》期刊。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了多项关键技术方法：收集11例尿毒症患者肾切除组织及8例无CKD健康肾供者样本作为人类肾活检队列；构建Ksp-Cre;c-Abl^flox/flox小鼠（c-Abl^Epi-cKO）实现TEC特异性基因敲除，并构建Ksp-tdTomato荧光报告小鼠标记TECs；建立单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）和单侧缺血再灌注损伤（unilateral ischemia–reperfusion injury，uIRI）两种经典肾纤维化小鼠模型；利用HK-2人近端肾小管上皮细胞系进行体外实验，包括慢病毒介导的基因敲低、质粒转染过表达、TGF-β1刺激、划痕愈合实验；采用转录组测序（RNA-seq）及生物信息学分析；运用免疫荧光、免疫组织化学、蛋白质印迹、核质分离、免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）等分子生物学技术；通过流式细胞术分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）鉴定和分离Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺双阳性细胞群体；使用ELISA检测细胞培养上清中细胞因子水平。

四、研究结果

1. c-Abl在人和小鼠纤维化肾脏中显著上调并富集于TECs

研究人员首先检测了CKD患者和健康供者肾脏以及UUO和uIRI诱导的纤维化小鼠模型中c-Abl的表达模式。人和小鼠纤维化肾脏中c-Abl的mRNA和蛋白水平均显著升高。UUO小鼠中c-Abl发生酪氨酸磷酸化并被激活。单细胞RNA测序数据分析显示，c-Abl在糖尿病肾病患者肾脏的TECs中富集，且在UUO小鼠纤维化肾脏的集合管主细胞中富集。免疫荧光分析证实，c-Abl主要在CKD肾组织的TECs中表达，尤其在AQP1⁺近端小管和Ksp⁺远端小管及集合管中。在小鼠纤维化肾脏中，c-Abl主要与Ksp⁺TECs共定位。利用Ksp-tdTomato报告小鼠，研究证实c-Abl与tdTomato⁺TECs共定位。

2. 小鼠肾小管特异性c-Abl缺失减轻肾纤维化重塑

研究人员通过构建Ksp-Cre;c-Abl^flox/flox小鼠（c-Abl^Epi-cKO）在体内肾小管中敲除c-Abl。c-Abl^Epi-cKO小鼠可存活、可育，与对照小鼠外观无差异。对c-Abl^con和c-Abl^Epi-cKO小鼠进行UUO和uIRI处理后，Masson染色和天狼星红染色显示c-Abl^Epi-cKO小鼠中促纤维化胶原沉积减弱。纤维化标志物（α-SMA、Col1a1、Vimentin和F4/80）表达显著降低，而上皮标志物E-cadherin升高。与组织学结果一致，受损c-Abl^Epi-cKO小鼠血清肌酐和血尿素氮水平低于受损c-Abl^con小鼠。这些结果表明TECs中的c-Abl有助于肾纤维化重塑和损伤相关的分子改变。

3. c-Abl在体外促进肾TECs纤维化反应和EMT

研究人员使用人近端肾TECs HK-2细胞系，经TGF-β1刺激后c-Abl和ECM蛋白上调。c-Abl激活在12小时达到峰值。用c-Abl shRNA慢病毒感染HK-2细胞并同时用TGF-β1处理后，c-Abl和ECM标志物表达降低；而c-Abl过表达本身足以增加ECM相关蛋白表达。c-Abl过表达还导致E-cadherin表达降低、Snail1和Twist1表达增加。过表达c-Abl改变了HK-2细胞的形态，从圆形上皮细胞转变为梭形成纤维细胞样细胞。划痕愈合实验显示c-Abl过表达的TECs迁移能力增强，而c-Abl敲低导致迁移能力显著降低。这些结果表明c-Abl在体外足以且必需促进TECs中ECM产生和EMT。

4. TEC特异性c-Abl缺失减弱纤维化肾脏中纤维化和炎症转录程序

研究人员对c-Abl^con和c-Abl^Epi-cKO UUO小鼠肾脏样本进行RNA测序分析。差异表达分析显示545个上调基因和499个下调基因。GO富集和热图分析显示，c-Abl^Epi-cKO小鼠中ECM组织相关基因下调。此外，细胞黏附、细胞因子分泌、胶原纤维组织，尤其是免疫和炎症基因明显减少。肾小管功能相关基因在c-Abl^Epi-cKO小鼠中显著上调，包括脂肪酸代谢过程和离子转运等肾小管代谢相关通路。GSEA分析显示c-Abl^Epi-cKO小鼠中EMT特征减少，Snail1和Twist1在c-Abl^Epi-cKO UUO和uIRI小鼠中显著下调。这些结果表明TECs中c-Abl缺失可阻断EMT进展、减轻炎症反应、保留肾小管上皮相关分子程序，最终保护肾小管健康。

5. c-Abl相关的Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺ TECs通过分泌促炎细胞因子促进肾纤维化

PDGFRα是肾间充质细胞标志物，标记表达ECM的细胞。研究人员推测PDGFRα可能表达于部分受损TECs中。免疫荧光染色和流式细胞术在Ksp-tdTomato UUO小鼠中发现了明显的tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞群体。c-Abl与Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺TECs共定位，且c-Abl^Epi-cKO-tdTomato UUO小鼠中双阳性细胞数量显著下降，证实双阳性细胞的形成依赖c-Abl。对分选的Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞进行分析发现，上皮标志物Cadh1和Cadh16未消失但显著下调，而ECM标志物Dcn、Vimentin和Col1a1显著增加，表明tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞经历了部分EMT。值得注意的是，与tdTomato⁺PDGFRα^?TECs相比，双阳性细胞中炎性因子和趋化因子表达明显增加，其中TGF-β1、IL-1β和CCL2富集最为显著。TGF-β1在tdTomato⁺PDGFRα^?TECs和健康肾小管细胞中弱表达，而在tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞中独特高表达。ELISA结果证实双阳性细胞组TGF-β1、IL-1β和CCL2显著增加。在CKD患者的肾小管上皮中也发现Ksp⁺PDGFRα⁺TECs显著增加。这些数据表明tdTomato⁺PDGFRα⁺TECs分泌高水平的促炎细胞因子和TGF-β1，代表具有炎症和促纤维化特征的独特肾小管上皮亚群，且与c-Abl活性相关。

6. c-Abl通过经典Wnt/β-catenin通路诱导HK-2细胞EMT

研究人员发现c-Abl^Epi-cKO小鼠中Wnt/β-catenin信号下调。双阳性细胞中MMP7、PAI-1和Twist1表达水平显著高于健康Ksp⁺上皮细胞，表明Wnt/β-catenin信号参与双阳性细胞的EMT。敲低c-Abl导致TGF-β1刺激诱导的β-catenin Y654磷酸化和GSK3β S9磷酸化降低，而c-Abl过表达足以增加β-catenin和GSK3β磷酸化。c-Abl过表达诱导的β-catenin核积累进一步表明c-Abl可能调控Wnt信号。Wnt抑制剂ICG-001基本逆转了c-Abl过表达诱导的EMT相关蛋白增加，并伴随β-catenin表达降低，强烈表明Wnt/β-catenin信号在c-Abl依赖性EMT中的关键作用。值得注意的是，ICG-001处理降低了c-Abl表达，提示c-Abl可能是Wnt/β-catenin的下游靶标。双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀实验证实TCF7直接结合c-Abl启动子以促进c-Abl转录。这些结果表明c-Abl通过c-Abl/Wnt/β-catenin正反馈环路诱导EMT。

7. c-Abl抑制剂通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT减轻UUO小鼠肾纤维化

GNF-5和尼洛替尼两种c-Abl抑制剂对健康肾脏无实质性损害，但减轻了UUO诱导的纤维化肾脏的结构改变和ECM合成。抑制剂处理小鼠UUO肾脏中与肾纤维化和炎症相关的基因显著下降，Wnt信号同时降低。Wnt信号下游靶标包括c-Abl显著下调。Snail1和Twist1的下调以及tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞数量的减少表明c-Abl抑制剂有效减轻EMT。药理学抑制c-Abl通过调控Wnt/β-catenin信号和EMT明显改善了UUO诱导的肾纤维化。

8. 临床样本中c-Abl与下游Wnt/β-catenin通路因子PAI-1和LEF1相关

研究人员利用Nephroseq数据库分析CKD患者和健康对照肾组织中PAI-1和LEF1的表达水平。Nakagawa CKD数据集分析显示，与正常对照相比，CKD患者肾组织中PAI-1和LEF1均显著上调。相关性分析显示c-Abl表达与PAI-1和LEF1呈强正相关。此外，在人类CKD转录组数据集中，c-Abl表达与EMT转录因子Twist1显著正相关，表明c-Abl激活与EMT相关转录程序之间存在关联。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究发现了一群独特的Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺促炎性TECs，这些细胞经历了一定程度的EMT并表达上皮和基质细胞特征基因。既往研究报道约30%的TECs表达α-SMA和胶原I，但只有少数细胞（约1%）从肾小管脱离成为肌成纤维细胞或其他间质细胞，表明肾小管细胞的EMT并不直接将上皮细胞转化为肌成纤维细胞。近期研究证实肾纤维化组织中的间质肌成纤维细胞主要来源于周细胞和成纤维细胞而非TECs。本研究首次鉴定Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺TECs构成独特的肾小管上皮亚群，其特征是炎性细胞因子和趋化因子产生增加。TGF-β1、IL-1β和CCL2在双阳性细胞中强富集，其中TGF-β1在双阳性细胞中独特高表达，表明这些细胞可能是TEC损伤后TGF-β1合成和分泌的来源。双阳性细胞分泌的TGF-β1可能通过多种方式发挥促纤维化作用：直接作用于系膜细胞和成纤维细胞诱导促纤维化反应；反过来作用于TECs自身促进EMT发生；促进成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和周细胞等多种细胞向肌成纤维细胞转分化。CCL2是糖尿病肾病炎症的主要促进因子，由实质细胞或TECs分泌的CCL2激活单核细胞前体分化为巨噬细胞并被募集到炎症组织。F4/80染色表明TECs中敲除c-Abl减轻了巨噬细胞募集和聚集，证明c-Abl通过影响tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞的形成来影响趋化因子分泌和巨噬细胞募集。

关于c-Abl在纤维化中的下游效应，研究发现c-Abl^Epi-cKO UUO小鼠中Wnt信号明显下调。β-catenin和GSK3β被c-Abl直接和间接磷酸化，导致β-catenin稳定和核转位以及GSK3β降解复合物失活，从而激活Wnt信号并导致EMT。本研究首次发现Wnt信号可反馈促进c-Abl表达，形成c-Abl–Wnt正反馈调控环路，导致Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺细胞逐渐增加和EMT持续进展，最终导致肾纤维化。

从转化角度而言，c-Abl抑制可能代表一种限制纤维化信号程序的潜在策略，通过靶向受损TECs中的异常信号发挥作用。鉴于人类CKD数据集中c-Abl激活与EMT程序之间的关联，靶向c-Abl可能具有超越UUO模型的更广泛治疗相关性，可扩展到糖尿病肾病或慢性移植物纤维化等临床相关CKD场景，但仍需进一步研究评估长期疗效、安全性和脱靶效应。

研究结论部分翻译如下：EMT如何发生及其在肾纤维化中的作用在很大程度上尚不清楚。本研究提供证据表明，TECs中的非受体酪氨酸激酶c-Abl通过激活Wnt/β-catenin信号促进EMT发展，而激活的Wnt/β-catenin信号反过来促进c-Abl表达，形成正反馈环路。研究人员还鉴定了c-Abl相关的Ksp-tdTomato⁺PDGFRα⁺TECs，其特征是炎性细胞因子和趋化因子产生增加，这与受损肾脏中的促纤维化特征相关。研究结果支持c-Abl作为CKD和肾纤维化治疗靶点的潜在临床应用价值。