《PLOS One》：Comparative genomics of seven Tenacibaculum maritimum isolates from farmed Atlantic salmon (Salmo salar), Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus), and lumpfish (Cyclopterus lumpus) in Canada and Norway reveals conserved features
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海生田吉氏杆菌（Tenacibaculum maritimum）是海洋鱼类的主要细菌性病原体，可导致多种鱼类发生溃疡性疾病暴发并引起高死亡率，是全球水产养殖业面临的重大挑战。本研究对七株新测序的T. maritimum分离株进行了特征分析，这些菌
专业摘要翻译
海生田吉氏杆菌（Tenacibaculum maritimum）是海洋鱼类的主要细菌性病原体，可导致多种鱼类发生溃疡性疾病暴发并引起高死亡率，是全球水产养殖业面临的重大挑战。本研究对七株新测序的T. maritimum分离株进行了特征分析，这些菌株分别分离自加拿大不列颠哥伦比亚省和挪威的养殖大西洋鲑（Salmo salar）、大西洋庸鲽（Hippoglossus hippoglossus）及圆鳍鱼（Cyclopterus lumpus），其中包括首株分离自挪威大西洋鲑的T. maritimum完整基因组。比较基因组学分析揭示了完整的IX型分泌系统（Type IX secretion system，T9SS）及典型的滑动运动相关机制（gliding-associated machinery）的存在。研究人员还鉴定了一个高度保守的候选T9SS底物库及若干主要的宿主互作蛋白。系统发育分析将这些分离株置于多个支持度良好的进化支中，这些进化支包含来自不同地理来源和宿主物种的菌株。O抗原基因簇（O-antigen gene cluster，O-AGC）的特征分析鉴定出三种不同类型（1?0、2?1和4?0），其分布与分离株间的系统发育关系不一致。四个挪威分离株在琼脂上的菌落发育受孵育温度强烈影响，在20–24°C下快速生长，在12–16°C下生长较慢，在8°C下仅有限生长。本研究扩展了T. maritimum可用的基因组资源，并强调了整合基因组与环境监测以改善水产养殖系统中田吉杆菌病（tenacibaculosis）管理的重要性。
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一、研究背景与意义
田吉杆菌病（tenacibaculosis）是一种溃疡性疾病，可在全球多种海洋鱼类中造成高死亡率，被认为是水产养殖业最具破坏性的细菌性疾病之一，造成重大经济损失并严重损害鱼类健康与福利。海生田吉氏杆菌（Tenacibaculum maritimum）最初于日本从表现口部糜烂、鳍条磨损和尾腐病的真鲷（Pagrus major）和黑棘鲷（Acanthopagrus schlegelii）中分离，当时被命名为Flexibacter maritimus，后于2001年随田吉氏杆菌属（Tenacibaculum）的建立被重新分类为T. maritimum。
尽管T. maritimum及其所属田吉氏杆菌属长期以来研究不足，但水产养殖中田吉杆菌病暴发的增加已引起学界对该重要病原体的关注。挪威最早于2014年从濒死养殖圆鳍鱼肾脏中分离到T. maritimum，此后又于2016年从养殖幼年圆鳍鱼中分离。值得注意的是，尽管T. maritimum存在于挪威水域，但此前尚未有该菌与挪威大西洋鲑溃疡性疾病相关的报道——这与该菌在加拿大不列颠哥伦比亚省养殖大西洋鲑中明确导致的“口腐病”（mouth rot）形成对比。2024年9月，T. maritimum首次从挪威西部一家陆基大西洋鲑养殖设施的溃疡性疾病暴发中被分离。
此前比较基因组学分析已揭示T. maritimum种群具有遗传结构，且多个预测的毒力相关因子在种内广泛保守。然而，不同宿主物种和地理区域的基因组代表性不均衡，尤其是来自挪威表现田吉杆菌病症状的大西洋鲑的分离株此前未有任何基因组代表。本研究正是为了填补这一空白而开展。
二、研究内容与主要发现
本研究对七株新测序的T. maritimum分离株进行了遗传特征分析，以扩展不同宿主物种和地理来源的基因组代表性。其中四株来自挪威：两株分离自大西洋鲑，一株来自大西洋庸鲽，一株来自圆鳍鱼；另有三株来自加拿大不列颠哥伦比亚省的大西洋鲑。四个挪威分离株还在不同孵育温度下培养，以考察菌落发育及对温度的体外响应。本研究提供了首株分离自挪威大西洋鲑的T. maritimum完整基因组。
主要发现包括：所有七株分离株均含有完整的IX型分泌系统（T9SS）和典型的滑动运动相关机制；候选T9SS底物库在七株间高度保守；五个主要的候选宿主互作蛋白（CslA软骨素酶AC、鞘磷脂酶Sph、多模块唾液酸酶SiaA、M43家族胶原酶和tenacilysin）在全部基因组中均有同源物；系统发育分析将分离株分布于多个进化支，且未发现与宿主物种或地理来源的明确对应关系；O抗原基因簇（O-AGC）鉴定出三种类型（1?0、2?1和4?0），其分布与系统发育关系不一致；挪威分离株的菌落生长和β-溶血活性均表现出强烈的温度依赖性。
三、主要技术方法
研究人员对六株分离株（CAN15?1、CAN16?1、CAN16?2、NLF15、NS17和NH18）采用Illumina NovaSeq 6000平台进行二代短读长测序，对F23K6采用PacBio Sequel II平台进行三代长读长测序并组装为单一环状染色体。基因组注释使用Prokka，泛基因组重建使用Panaroo，功能注释使用eggNOG-mapper。T9SS鉴定使用MacSyFinder结合TXSScan模型库；候选T9SS底物通过HMMER搜索TIGR04183.1和TIGR04131.1模型鉴定；信号肽预测使用DeepSig。系统发育分析采用ALPPACA流程构建核心基因和核心基因组系统发育树，使用IQ-TREE推断最大似然系统发育。O-AGC分型采用Lopez等建立的基于多重PCR的血清分型方案进行in silico鉴定，并用clinker进行可视化比较。此外还进行了抗菌素耐药基因筛查（ABRicate和AMRFinderPlus）、质粒筛查（MOB-suite）和前噬菌体区域鉴定（PHASTEST）。四个挪威分离株在BAMA琼脂培养基上于4°C、8°C、12°C、16°C、20°C和24°C六个温度下培养，每日观察菌落发育和β-溶血活性。
四、研究结果
基因组特征与比较基因组学特征： F23K6的PacBio长读长组装产生单一环状染色体，全长3,390,651 bp，GC含量31.93%，含2,974个蛋白编码序列（CDS）、六个完整的rrn操纵子和57个tRNA序列。六个Illumina组装包含59–190个重叠群，总组装大小3,370,865–3,683,213 bp，GC含量31.66–31.87%。泛基因组分析鉴定出4,775个直系同源基因家族，其中2,312个为核心家族（存在于全部七株）。TXSScan在所有七株中均鉴定出完整的T9SS组分库，系统完整性评分为1.0。每株基因组中鉴定出49–53个候选T9SS底物，包含42–45个A型（Type A）和7–8个B型（Type B）C端分选结构域蛋白。五个候选宿主互作蛋白在全部七株中均检测到全长同源物，仅NLF15的Sph同源物由两个相邻预测CDS代表。未在任何基因组中检测到抗菌素耐药基因或质粒。PHASTEST在CAN15?1中鉴定出一个23,512 bp的完整前噬菌体区域，在CAN16?2中鉴定出一个11,443 bp的不完整前噬菌体区域，在NLF15和NS17中鉴定出相同的21,493 bp可疑前噬菌体区域。O-AGC分型将NS17和CAN15?1归为1?0型，F23K6归为2?1型，NLF15、NH18、CAN16?1和CAN16?2归为4?0型。
T. maritimum系统发育： 核心基因系统发育基于2.45 Mb比对（83,513个简约信息位点，2,216个核心基因），将分离株分为两个主要进化支，平均间隔39,460个SNP。先前描述的核心基因组进化支A、B、C均被恢复：F23K6与韩国来源的TM-KORJJ菌株同属进化支B；NH18与两株挪威圆鳍鱼来源菌株及两株西班牙菌株同属进化支C；进化支A仅含三株地中海分离株。加拿大三株大西洋鲑分离株与挪威的NLF15和NS17及两株塔斯马尼亚分离株（TCFB 4574和TCFB 0814）形成一个独特的、支持度良好的单系进化支，被暂定为进化支D。同一暴发来源的分离株形成支持度良好的单系群。核心基因组系统发育显示与核心基因系统发育相似的拓扑结构。
不同温度下挪威T. maritimum分离株的生长：** 四个挪威分离株的菌落发育强烈依赖于孵育温度。48小时后，4°C和8°C下无可见生长，12°C下仅微弱生长，16°C下生长清晰可见，20°C和24°C下沿接种划线形成大量发育良好的菌落。16°C下菌落呈淡紫色并具典型粗糙表面形态，20°C和24°C下菌落开始呈现深绿褐色。8°C下约5天后才出现微弱生长且七天后仍有限。4°C下14天无可见生长。β-溶血活性在16°C、20°C和24°C下48小时后可检测到，12°C下约4–5天后出现，8°C下未观察到。在20°C和24°C下，溶血区域在菌落横向扩展停止后仍持续扩大。
五、讨论与结论
本研究扩展了T. maritimum的基因组资源，包括首株分离自挪威大西洋鲑的完整基因组。尽管分离株来源的宿主和地理区域不同，但共享广泛保守的分泌、运动和宿主互作特征库。五个候选宿主互作蛋白及T9SS的保守性表明，组织降解和膜损伤相关机制在种内广泛分布，与其广泛的宿主范围一致。基因组可塑性由附属组分的微小变异（如前噬菌体获得、移动遗传元件）支持，但未观察到主要毒力因子的株特异性获得或丢失，提示宿主互作相关的遗传组分在种内高度保守。
系统发育分析揭示T. maritimum种群高度结构化，但未显示与宿主物种或地理来源的清晰关联模式，表明该菌不具有强宿主特异性或地方性。然而，同一暴发来源的分离株形成支持度良好的单系群，支持田吉杆菌病暴发为局部克隆或近克隆性流行病的模型。O-AGC类型分布与系统发育不一致，提示O抗原生物合成位点通过水平基因转移或重组独立于核心基因组进化，表面抗原变异可能受宿主免疫互作或环境适应等选择压力驱动。
温度实验表明，T. maritimum在体外菌落发育和β-溶血活性均强烈依赖于温度，20–24°C下快速生长，8°C下仅缓慢生长。挪威分离株在8°C下缓慢生长的能力可能使其在较冷季节持续存在，而高于约16°C时的快速生长可能促进季节性细菌丰度增加。挪威2024年和2025年分别有15个和17个大西洋鲑养殖场报告检出T. maritimum，且两起暴发事件均发生在海水温度超过15°C的时期，支持温度是T. maritimum增殖的重要环境驱动因素。
总体而言，本研究支持T. maritimum是一种分布广泛的海洋细菌且具有保守的致病潜力的模型。分离株间有限的基因组变异提示仅基于基因分型预测暴发风险和严重程度可能不足。温度对细菌生长的显著影响支持温度作为T. maritimum生态学的主要环境因素，并强调环境监测的必要性。持续监测T. maritimum在水产养殖系统中的存在仍然至关重要，包括该菌可能形成丰富生物膜从而促进环境持续存在的设施表面。
