果蝇雄性特异转录因子fruitless（fruM）调控埃及伊蚊雄虫对雌性飞行声音的趋声行为

《PLOS Biology》：fruitless is essential for male Aedes aegypti mosquito attraction to female flight sounds

　　

雄性蚊虫通过强烈且先天性的对雌性飞行声音的趋声行为来定位雌性，这是这种世界上最致命动物的交配基础。相比之下，雌性不表现出任何声音趋近行为。尽管这一现象已被记载近一个世纪，但这些行为二态性的分子基础仍不清楚。本研究发现，通过破坏埃及伊蚊（Aedes aegypti）中fruitless的雄性特异性剪接异构体（称为fruM），fruM突变雄虫的声音趋近行为完全消失，导致突变雄虫无法定位雌性进行交配。研究人员在对照雄虫的耳朵中检测到强烈的fruitless表达，而FruM的缺失严重破坏了突变雄虫放大雌性飞行声音的能力。fruM突变雄虫的耳朵在频率特异性声音诱发电信号上的传播幅度仅为对照雄虫的约六分之一，显著减少了传递至大脑的听觉信息量。因此，fruitless在决定雄虫外周听力功能以支持交配方面发挥着重要作用。对蚊虫耳朵的转录组学分析鉴定出关键的听觉基因，这些基因受到FruM通过直接或间接作用的转录调控，从而塑造了支持雄虫对雌性飞行声音产生趋声行为的雄性特异性听觉细胞机制。该研究表明，FruM通过直接控制听觉器官性能的最早期阶段——声音放大和声学信号检测，来主导涉及交配的雄性特异性听觉行为。研究结果揭示，FruM对于蚊虫雄性特异性生殖行为至关重要。

研究背景与科学问题

蚊虫的性别二态性生殖行为已被记载近一个世纪。在传播疾病的蚊虫中，雄虫在黄昏形成以雄性为主的交配群，并对雌性飞行声音表现出强烈的先天性趋声行为（phonotaxis）以定位雌性。雌性既不集群也不表现出趋声行为，而是寻求宿主、吸血和产卵。然而，这些行为二态性的分子基础长期未知。此前研究虽发现fruitless（fru）在果蝇中调控雄性性行为，但在蚊虫中其具体作用机制尚不清楚。特别是，已知fru^M突变雄虫交配失败且不能使雌性受精，但根本原因不明。本研究旨在阐明Fru^M如何调控雄虫的听觉行为及其在交配中的关键作用。

研究内容与结论

研究人员利用埃及伊蚊（Aedes aegypti）的fru^M突变体，结合行为学、神经生理学、解剖学和转录组学等多学科手段，系统揭示了Fru^M作为雄虫生殖行为主调控因子的作用机制。研究发现，fru^M突变导致雄虫完全丧失中央飞行模式（central flight pattern）和趋声行为，进而无法成功交配。Fru^M在雄虫约翰斯顿氏器（Johnston's Organ, JO）神经元中强烈表达，其缺失显著改变了雄虫外周听觉功能：突变雄虫耳朵的机械调谐频率（mechanical tuning frequency）升高，电调谐频率（electrical tuning frequency）也相应升高；更重要的是，雄虫特有的自持振荡（self-sustained oscillations, SOs）完全消失，而这种振荡反映的是雄虫将雌性飞行声音放大上千倍的能力；同时，纯音刺激诱发的触角神经复合动作电位幅度降低约六倍，表明听觉信息向大脑的传递显著减少。解剖学分析显示，Fru^M影响JO内传出神经突触末梢的性别特异性定位，突变雄虫丧失了雄性特异性VI型末端并获得雌性特异性III型末端。转录组学分析鉴定出受Fru^M调控的关键听觉基因，包括抑制雌性偏向基因（如动力蛋白轻链基因Dlc90F）和促进雄性偏向基因（如多种动力蛋白重链基因）。通过基序富集分析和蛋白质-DNA相互作用实验，研究人员鉴定了Fru^M的结合DNA基序，并证实Fru^M可直接结合到Dlc90F增强子区域的两个位点。该研究首次证明Fru^M是蚊虫雄性特异性听觉行为的主调控因子，通过直接控制外周听觉器官的性能来决定交配结果，并提出fruitless可作为蚊虫遗传防控的新靶点。

主要关键技术方法

1. 1.
   行为学分析：使用BuzzWatch飞行轨迹追踪系统分析蚊虫飞行模式，计算轨迹中心度指标r₅₀值；采用麦克风记录和SimbaR软件包分析飞行计数和翅振频率（WBF）；建立群体水平趋声行为实验装置，通过播放纯音并计数趋近扬声器的雄虫数量评估趋声反应；视频记录单个雄虫的声音诱导腹部弯曲行为。
2. 2.
   听觉生理学测量：利用激光多普勒测振仪（laser Doppler vibrometry）测量蚊虫鞭毛尖端振动速度，拟合受迫阻尼谐振子函数提取机械调谐频率；同步进行电生理记录，在触角神经基部插入电极测量声音诱发的复合动作电位（compound action potentials），获取电调谐频率和神经反应阈值。
3. 3.
   免疫荧光与解剖学分析：对固定后的蚊虫头部进行振动切片（40μm厚度），使用抗SYNORF1（3C11）和抗SAP47（nc46）抗体标记突触前末端，抗HRP抗体标记神经纤维，抗DsRed抗体标记tdTomato，通过共聚焦显微镜成像观察JO结构并量化突触前末端类型分布。
4. 4.
   转录组学分析：对分离的蚊虫柄节（pedicel）进行RNA测序（RNA-seq），使用DESeq2进行差异表达基因分析，结合已发表的单核RNA测序（snRNA-seq）数据和头/柄节RNA-seq数据库筛选JO神经元特异性表达基因。
5. 5.
   生物信息学与分子互作验证：对差异表达基因上游1kbp增强子序列进行基序富集分析（motif enrichment analysis），使用AlphaFold3预测Fru^M锌指结构域（Zn-B）与候选DNA基序的相互作用，并通过电泳迁移率变动分析（EMSA）验证Fru^M锌指结构域与Dlc90F增强子区域的直接结合。

研究结果

Fru^M突变消除雄虫中央飞行模式和趋声行为

通过BuzzWatch追踪系统和热图分析，研究人员发现对照雄虫在黄昏时倾向于飞向笼子中央，而fru^M突变雄虫和对照雌虫则沿笼壁飞行，定量结果显示对照雄虫的r₅₀值显著低于其他两组。麦克风记录表明，fru^M突变雄虫的飞越次数（fly-bys）显著少于对照雄虫，与雌虫相似，但三组间的翅振频率（WBF）无显著差异。在趋声实验中，fru^M突变雄虫对所有测试纯音（350-850Hz）均无趋近反应，而对照雄虫和杂合子雄虫则表现出强烈的频率特异性趋声行为。此外，fru^M突变雄虫的声音诱导腹部弯曲行为也完全消失。

JO神经元表达fru，Fru^M突变改变雄虫听觉功能

通过对已发表的snRNA-seq数据重分析，研究人员发现fru在假定的JO神经元簇中强烈广泛表达，并在柄节组织中经历性别特异性可变剪接。免疫染色证实fru在雄虫JO神经元中高表达。激光多普勒测振和电生理联合测量显示，fru^M突变雄虫的白噪声刺激机械调谐频率显著高于对照雄虫，而被动状态（CO₂麻醉）下的机械调谐频率在两雄虫组间无差异，表明主动听觉特性发生了改变。重要的是，对照雄虫耳的机械调谐范围覆盖整个雌性WBF范围，而fru^M突变雄虫耳与此重叠极小，表明其放大雌性飞行声音的能力受损。电生理记录进一步显示，fru^M突变雄虫的电调谐频率显著升高，电反应阈值升高，纯音诱发的触角神经反应幅度仅为对照雄虫的约六分之一，但静态偏转诱发的紧张性反应（tonic response）在两组间无差异。

Fru^M影响雄虫JO内传出突触末梢的定位

通过免疫荧光染色观察突触前标记物（3C11和nc46），研究人员在对照雄虫中鉴定出雄性特异性II、IV、V和VI型突触末梢以及雌性特异性III型末梢。fru^M突变雄虫的JO中，雄性特异性V型末梢减少，VI型末梢完全缺失，同时获得了雌性特异性III型末梢。注射破伤风毒素（TeNT）阻断传出信号后，仅对照雄虫能诱发自持振荡（SOs）；注射cAMP直接激活JO神经元后同样如此，表明Fru^M对于建立雄虫特有的SO机制至关重要。

Fru^M抑制雌性偏向基因表达并调控雄性偏向基因表达

柄节RNA-seq的PCA分析显示，基因型解释了42%的方差。差异表达分析鉴定出1252个基因在fru^M突变雄虫中上调，994个下调。通过筛选柄节高表达且在JO神经元中表达的基因，研究人员识别出三个关键基因集合：s₁₄₂（在fru^M突变雄虫和对照雌虫中均高于对照雄虫的基因），包含雌性偏向的动力蛋白轻链基因Dlc90F；s₁₇₅（仅在对照雄虫中高表达的基因），包含四种编码纤毛运动装置的雄性偏向基因；s₂₅₇（表达量从雌虫到对照雄虫再到fru^M突变雄虫递增的剂量依赖性基因），包含两种动力蛋白重链基因。

基序富集分析鉴定出推定的Fru^M结合DNA基序并验证其与Fru^M蛋白DNA结合域的相互作用

通过基序富集分析，研究人员在s₁₄₂基因组的增强子区域鉴定出一个与果蝇Fru^MB结合基序高度相似的推定Fru^M结合基序簇。RNA-seq数据显示，编码B型C₂H₂锌指结构域（Zn-B）的外显子在雄虫柄节中表达最高。AlphaFold3预测显示Zn-B结构域与共识基序之间存在特异性相互作用，其中第2、3和5位核苷酸是关键接触位点。扫描分析发现，s₁₄₂基因中有55.6%含有至少一个共识基序，显著高于非差异表达基因组（40.9%）。EMSA实验证实，Fru^M的Zn-B结构域可直接结合Dlc90F增强子区域的两个推定结合位点，而去除Zn-B结构域的截短蛋白则失去结合能力。

讨论与结论总结

讨论部分指出，Fru^M是雄虫生殖行为的主调控因子，其缺失完全消除了雄性特异性中央飞行模式和趋声行为，导致交配失败。研究强调，fru^M突变雄虫的交配失败源于趋声行为和声音诱导腹部弯曲行为的完全丧失，这部分归因于突变雄虫耳朵机械反馈放大、声音检测和听觉信息处理的缺陷，包括SOs消失、调谐频率升高和纯音诱发神经反应显著减弱。Fru^M在设定雄虫耳朵对雌性飞行声音的高频敏感性和选择性方面发挥重要作用，但突变雄虫耳朵仍显示活跃听觉特征，并非完全失聪，因此趋声行为的完全丧失也可能涉及Fru^M在中枢听觉处理中的作用。与果蝇不同，埃及伊蚊的JO神经元中fru表达强烈而广泛，表明进化分歧。Fru^M通过转录网络调控雄性偏向和雌性偏向基因的表达平衡，实现雄虫耳朵的雄性化。研究结论：Fru^M是雄虫听觉行为的主调控因子，通过直接控制外周听觉器官的性能来影响交配结果，fruitless可作为基于遗传控制的蚊虫防控新靶点。