《PLOS Genetics》：CDH1 loss remodels gene expression and lineage identity in human mammary epithelial cells
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侵袭性小叶癌（invasive lobular carcinoma, ILC）是乳腺癌的常见亚型，其分子特征为约95%的ILC中存在CDH1基因的遗传性缺失，并由此导致细胞黏附蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的缺失。尽管CDH1缺失发生在ILC肿瘤发生
侵袭性小叶癌（invasive lobular carcinoma, ILC）是乳腺癌的常见亚型，其分子特征为约95%的ILC中存在CDH1基因的遗传性缺失，并由此导致细胞黏附蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的缺失。尽管CDH1缺失发生在ILC肿瘤发生的早期，但其如何促进细胞转化尚不清楚。研究人员利用“正常”人乳腺上皮细胞（human mammary epithelial cells, HMEC）模拟早期CDH1缺失，即有限增殖寿命且反映早期增生的细胞，并通过抗体靶向E-cadherin信号，或使用siRNA及CRISPR/Cas9敲除（CRISPR/Cas9-knockout）造成CDH1遗传缺失。对四个HMEC模型的转录组分析表明，E-cadherin靶向方式对后续表型至关重要。抗体介导的细胞间接触抑制诱导了上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的基因特征，这与E-cadherin抑制在EMT过程中的作用一致。相反，与ILC肿瘤发生过程相同的CDH1遗传缺失则抑制EMT特征，并将基因表达重塑为腔上皮（luminal epithelial）表型。RNA-seq、单细胞转录组学、流式细胞术、显微镜和ATAC-seq分析支持CDH1缺失诱导向腔上皮状态的谱系重塑，这一现象在临床ILC前驱病变的转录组分析中同样得到印证。通过在CDH1敲除前分离腔上皮细胞与基底细胞，研究人员发现CDH1缺失在两个细胞群体中均诱导谱系身份重塑，并汇聚为一种具有腔上皮祖细胞样表型的新谱系稳态。与向腔上皮祖细胞表型的转变一致，CDH1缺失在HMEC有限增殖寿命内增强了增殖能力，提示早期CDH1缺失可能通过克隆优势促进肿瘤起始。此外，CDH1缺失增强了失巢凋亡抵抗（anoikis resistance），这是ILC细胞的标志性特征。研究结果支持CDH1在乳腺上皮细胞中的遗传缺失可诱导转录及表型变化，该变化与向腔上皮祖细胞样状态的谱系身份重塑一致，这可能构成早期CDH1缺失介导ILC肿瘤发生的机制基础。
论文解读：CDH1缺失重塑乳腺上皮细胞谱系身份并促进侵袭性小叶癌早期发生
侵袭性小叶癌（invasive lobular carcinoma, ILC）是乳腺癌最常见的特殊组织学亚型，约占所有新发乳腺癌的15%。其分子标志是编码E-钙黏蛋白（E-cadherin）的CDH1基因发生遗传性缺失，典型机制为CDH1功能丧失性突变伴随16q22.1杂合性缺失。CDH1缺失与ILC特征性的“单排”黏附不良生长模式、独特转移方式及失巢凋亡抵抗密切相关。重要的是，CDH1缺失是ILC肿瘤发生中的早期事件，约95%的非典型小叶增生（atypical lobular hyperplasia, ALH）和小叶原位癌（lobular carcinoma in situ, LCIS）病变已呈E-cadherin阴性。然而，ILC的临床进展机制仍不清楚，且良性ILC前驱病变的临床管理缺乏明确指南。鉴于CDH1在ILC肿瘤发生中的核心作用，阐明CDH1缺失后癌症进展的机制，对于改善患者风险评估及理解CDH1作为肿瘤抑制因子的功能具有重要意义。
既往研究多关注E-cadherin在转移阶段的可逆性抑制或EMT中的作用，但ILC中的CDH1缺失既不可逆也不伴有典型EMT特征，提示其机制与EMT相关E-cadherin抑制截然不同。此外，ILC的乳腺起源细胞尚未明确。乳腺主要由腔上皮细胞和基底（肌上皮）细胞两种上皮谱系构成，E-cadherin在两者中均有表达。遗传修饰小鼠模型显示，不同启动子驱动的Cre重组酶对ILC样肿瘤发生的支持程度不同，提示细胞谱系定向可能对ILC肿瘤发生至关重要。为探究CDH1基因缺失如何促进ILC发展，研究人员在“正常”非转化人乳腺上皮细胞（HMEC）中模拟了功能性E-cadherin抑制与CDH1遗传缺失的不同模式。
研究人员利用来自健康供体乳房成形术组织的有限增殖寿命HMEC，并通过过表达CCND1（在约40%的ILC中发生拷贝数扩增）克服复制性衰老，从而建立早期增生模型。共使用四个供体来源的HMEC模型（122D1、153D1、184D1、240D1），分别采用三种E-cadherin靶向方式：抗E-cadherin单克隆抗体（HECD-1，α-Ecad）阻断细胞间接触、CDH1 siRNA（siCDH1）以及多西环素诱导的CRISPR/Cas9基因敲除（CDH1-KO）。通过RNA-seq、单细胞RNA测序（PIP-seq）、ATAC-seq、流式细胞术、集落形成实验、增殖及失巢凋亡实验，结合临床LCIS组织转录组分析，系统评估了CDH1缺失对细胞表型和谱系身份的影响。临床样本包括来自明尼苏达大学的22例LCIS存档组织（其中4例为多形性LCIS，后续分析中排除）和7例正常乳腺组织。
主要研究结果如下：
1. E-cadherin的遗传缺失抑制EMT并转向腔上皮转录状态。对四种HMEC模型进行RNA-seq分析发现，抗体抑制E-cadherin可激活缺氧和EMT信号，而siRNA或CRISPR/Cas9造成的CDH1遗传缺失则抑制EMT、上调腔上皮相关基因并下调基底相关基因。这表明ILC中的CDH1缺失与EMT过程中的E-cadherin抑制在机制上截然不同。
2. 单细胞分析支持CDH1-KO诱导腔上皮和基底细胞重编程。PIP-seq对184D1细胞（NTG对照与CDH1-KO）共获得36,956个细胞转录组。CDH1缺失使腔上皮细胞比例增加约3.5倍，同时降低腔上皮和基底亚群内各自谱系特征的“极化”程度，并增加增殖期细胞比例。G1期细胞分析显示，KRT16和ID2等腔上皮祖细胞相关基因上调，提示CDH1缺失诱导祖细胞样特征。
3. 染色质景观支持CDH1缺失引起的细胞身份变化。ATAC-seq分析显示，CDH1敲低后大部分染色质可及性位点保持不变，但获得性开放位点相关基因显著上调，并富集腔上皮相关标记（如KCNK5、PDK4、CPT1A），而丧失性关闭位点相关基因下调，涉及基底和EMT相关因子（如SERPINE1、SPHK1、TP63等）。基序分析发现，获得性开放位点富集NFI、TFAP2C、KLF4/5等与腔上皮祖细胞身份相关的转录因子基序，而丧失性开放位点富集AP1和TP63等基底/EMT相关基序。
4. CDH1缺失在HMEC中重现早期小叶瘤变的基因表达变化。对18例经典型LCIS与7例正常乳腺组织进行RNA-seq发现，腔上皮标记（MUC1、FOXA1、KRT18、KRT8、ESR1）在LCIS中上调，基底标记（KRT5、KRT14、ITGA6、TP63）下调；雌激素反应通路激活，而顶侧连接通路受抑制，与HMEC模型中CDH1缺失导致的腔上皮谱系转变一致，并与DCIS中EMT激活的报道形成对比。
5. 细胞谱系标记支持CDH1缺失诱导腔上皮祖细胞样表型。流式细胞术分析EpCAM/CD49f发现，CDH1-KO使184D1细胞从基底（EpCAMlo）向腔上皮（EpCAMhi）转变，并富集EpCAMhi/CD49fhi腔上皮祖细胞群。CD10（祖细胞能力标志）在EpCAMhi细胞中表达增加。利用饲养层集落形成实验，CDH1-KO后形成的集落绝大多数呈腔上皮表型，而NTG对照以基底表型为主，从功能上证实了谱系表型的转变。
6. CDH1-KO在腔上皮和基底细胞中均诱导谱系重塑。通过流式分选预先分离EpCAMhi和EpCAMlo细胞，再诱导CDH1-KO，发现两个起始群体在敲除后均向EpCAMhi状态汇聚，而NTG对照则恢复原有的EpCAMlo基线，表明CDH1缺失并非通过选择基底细胞死亡发挥作用，而是主动驱动两个谱系向新的腔上皮稳态重塑。
7. CDH1缺失诱导谱系标记物的时间性转变。对CDH1-KO后17天的时间过程分析显示，E-cadherin蛋白在第7天达到稳定低水平；此后祖细胞标记MME/CD10、KRT16、KRT6B、ALDH1A3先升后维持，腔上皮标记EPCAM和基底标记ITGA6/CD49f分别在第10–14天达到新的稳定水平，提示siRNA的急性效应最终驱动了10–17天内的表型重塑。
8. CDH1-KO增强增殖能力和失巢凋亡抵抗。在HMEC有限寿命内，CDH1-KO细胞较NTG对照具有更高的群体倍增数和增殖速率（g1和g2分别为NTG的2.3倍和2.6倍）。在超低附着培养中，CDH1-KO细胞中E-cadherin阴性群体的存活率超过60%，而NTG对照低于30%，表明CDH1缺失足以赋予失巢凋亡抵抗这一ILC标志性特征。
讨论与结论方面，研究者总结认为，CDH1缺失不同于E-cadherin功能性抑制，其在人乳腺上皮细胞中诱导谱系身份重塑，驱动腔上皮祖细胞样表型的产生；该重塑在腔上皮和基底细胞中均发生，并与临床LCIS的基因表达变化一致。染色质可及性改变提示ID2等候选因子可能介导这一过程。CDH1缺失增强了增殖能力和失巢凋亡抵抗，将谱系重塑与ILC肿瘤发生的关键表型联系起来，为早期CDH1缺失如何促进ILC提供了机制性解释。研究结论可翻译为：研究人员指出，CDH1缺失诱导腔上皮和基底乳腺细胞发生腔上皮祖细胞样重编程，创造了一个可能允许ILC肿瘤发生的细胞环境。通过识别与该重编程相关的潜在机制驱动因子和增殖过程，研究结果为识别、评估和靶向早期小叶病变以评估风险并预防ILC进展提供了新机遇。该工作为未来探究ILC病因学及其独特侵袭和转移机制奠定了坚实基础。
