去氧去氢甘松醇A和甘松水提取物通过调节Nrf2/HO-1信号通路改善尘螨诱导的特应性皮炎

《Fitoterapia》：Desoxo-narchinol A and water extract of Nardostachys jatamansi ameliorate house dust mite-induced atopic dermatitis by regulating Nrf2/HO-1 signaling

　　甘松水提取物（WENJ）减轻了尘螨提取物（DfE）诱导的NC/Nga小鼠特应性皮炎样皮肤炎症。WENJ减少了免疫细胞浸润和炎症介质表达，同时恢复了DfE处理的NC/Nga小鼠中皮肤屏障蛋白的表达。转录组分析显示WENJ激活了Nrf2/HO-1通路。WENJ及其主要成分去氧去甲萘酚A增加了角质形成细胞中Nrf2/HO-1的表达。分子对接分析显示去氧去甲萘酚A与Keap1结合，从而可能激活Nrf2/HO-1信号通路。WENJ有潜力作为改善炎症性皮肤疾病的治疗候选药物。引言特应性皮炎（AD）是一种慢性、复发性炎症性皮肤病，以结构屏障缺陷和辅助性T细胞（Th）介导的免疫失衡为特征[1]，[2]。持续且过度暴露于过敏原（如屋尘螨）会诱导氧化应激，削弱抗氧化防御反应，并损害皮肤屏障结构[3]。这些变化伴随着角质形成细胞和常驻免疫细胞中促炎趋化因子和细胞因子的产生增加。这些事件放大炎症信号，并进一步启动全身免疫激活，表现为肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润到病变皮肤中[4]，[5]。这些过程因此产生特征性的Th介导免疫反应，早期AD主要与Th2驱动的免疫相关，而慢性AD则表现为混合Th1/Th2型特征。AD发病机制以皮肤中氧化应激增加为特征[6]。在过敏原诱导的AD样皮肤炎症病变中，活性氧（ROS）水平在致敏期和激发期均升高，随后出现病变和全身免疫反应[7]，[8]。核因子E2相关因子2（Nrf2）作为皮肤氧化还原稳态的主要转录调节因子[9]。Nrf2调节多种抗氧化酶的转录，包括血红素加氧酶-1（HO-1），从而减轻氧化应激，否则氧化应激会促进炎症免疫激活并损害皮肤屏障蛋白[10]，[11]。除抗氧化作用外，Nrf2还负向调节促炎细胞因子如白细胞介素（IL）-4和IL-13的表达[12]，这些细胞因子负责抑制角质形成细胞中皮肤屏障蛋白（包括丝聚蛋白和兜甲蛋白）的表达[3]。这些功能使Nrf2能够维持屏障完整性并保护皮肤结构免受氧化损伤。内源性Nrf2的显性负性抑制导致兜甲蛋白缺陷小鼠皮肤屏障功能严重受损以及子宫内屏障缺陷[13]，[14]，提示Nrf2在氧化应激和皮肤屏障功能中发挥关键调节作用。在氧化应激反应中，Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）与Nrf2解离，从而阻止Nrf2泛素化及随后的蛋白酶体降解[15]。Nrf2随后易位至细胞核，与小Maf蛋白异二聚化。该复合物与抗氧化反应元件结合，诱导HO-1等抗氧化基因的转录[16]，[17]。鉴于Keap1在调节Nrf2活性（在氧化应激反应和皮肤屏障功能中）的核心作用，鉴定未识别的Nrf2/Keap1轴植物化学调节剂可能代表AD的一种新型治疗策略。锦毛鼠/名古屋（NC/Nga）小鼠是一种近交系小鼠，对过敏原致敏剂产生皮肤炎症，并表现出与人类皮肤病（如AD）相似的特征[18]。粉尘螨提取物（DfE）是家用纺织品中常见的一种屋尘螨，已被用作生物皮肤致敏剂来研究AD样皮肤炎症的发病机制[19]。在NC/Nga小鼠中应用DfE诱导皮肤氧化应激增加，进而削弱皮肤屏障功能，随后激活常驻角质形成细胞和免疫细胞[20]，[21]。DfE诱导的小鼠皮肤炎症的真皮和表皮层的临床病变症状和组织学特征也与AD患者观察到的皮肤症状密切相关[22]。此外，在DfE处理的小鼠中，在AD进展的急性至慢性期观察到促炎细胞因子和趋化因子水平显著改变，以及血清免疫球蛋白（Ig）E和组胺水平升高[23]。这些发现表明NC/Nga小鼠是评估炎症性皮肤病潜在治疗药物疗效的成熟体内模型。甘松（Nardostachys jatamansi）是败酱科植物，在韩国和中国被用作传统药物，主要用于改善胃肠功能和作为中枢神经系统镇静剂[24]。植物化学研究表明其主要生物活性成分为萜烯、萜类化合物和酚类，而糖苷、香豆素、木脂素和新木脂素以不同含量存在。甘松表现出广泛的生物活性，包括抗炎、心脏保护、抗菌、神经保护和/或抗氧化作用[24]，[25]。几种倍半萜类成分，如去氧去甲萘酚A和甘松醇B，通过激活Nrf2/HO-1通路抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，从而改善神经炎症[26]。此外，cycloolivil（甘松甲醇提取物中的酚类木脂素）通过阻断NF-κB和Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活因子（STAT）活化，抑制TNF-α/IFN-γ诱导的HaCaT角质形成细胞趋化因子产生[27]，提示甘松具有减轻皮肤炎症的潜力。早期一项体内研究表明，甘松通过降低人肥大细胞中血清IgE水平和促炎细胞因子水平（IL-6、IL-8和TNF-α），抑制BALB/c小鼠中1-氟-2,4-二硝基苯诱导的AD样皮肤病变[28]。然而，甘松对DfE诱导的AD样皮肤炎症的具体药理作用仍未探索。因此，本研究旨在探讨甘松水提取物（WENJ）对DfE诱导的AD样皮肤炎症模型的影响。我们还对小鼠皮肤进行了转录组分析，以阐明WENJ作用背后的基因表达特征和分子通路。我们进一步研究了WENJ主要成分去氧去甲萘酚A对IL-4/IL-13刺激的人正常成人表皮角质形成细胞（HEKs）中Nrf2/HO-1信号通路的影响。最后，我们验证了去氧去甲萘酚A与Keap1（Nrf2的关键调节因子）的分子结合亲和力。章节片段甘松水提取物（WENJ）的制备干燥甘松（Naemome Dah，韩国蔚山）采用水热回流提取法提取，温度保持在100±2°C以下。制备的WENJ经蒸发和反复浓缩，最终冻干（凭证号：KIOM 182）。将粉末状WENJ溶于蒸馏水中用于体外实验，或溶于无特定病原体（SPF）级水中用于动物实验。超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-TQ-MS/MS）分析为了定量WENJ中五种化合物的含量，将粉末提取物WENJ中五种成分的定量分析采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-TQ-MS/MS）在动态多反应监测（MRM）模式下，通过化合物特异性优化对WENJ中的五种倍半萜类化合物进行定量分析。优化的MRM参数，包括前体/产物离子转换和碰撞能量（CEs），以及各分析物的定量浓度，见表1。保留时间和讨论本研究表明WENJ减轻了DfE诱导的NC/Nga小鼠AD样皮肤炎症，系统的转录组分析确定Nrf2为WENJ作用的主要因素。通路水平分析进一步揭示，在AD模型中受抑制的Nrf2通路在WENJ治疗后显著恢复。此外，相关性分析显示Nrf2和HO-1表现出一致的表达模式，支持在结论本研究中，WENJ有效恢复了皮肤屏障蛋白表达并下调了炎症介质水平，从而减轻了DfE诱导的AD样皮肤炎症模型中的全身免疫激活。去氧去甲萘酚A是WENJ的关键成分，在IL-4/IL-13刺激的角质形成细胞中增加了Nrf2/HO-1表达，并显示出与Keap1的显著结合亲和力。这些发现表明WENJ及其活性成分可以减轻DfE诱导的AD样皮肤CRediT作者贡献声明Ki-Shuk Shim：写作—审阅与编辑，写作—原稿，调查。Hye Jin Kim：调查，数据管理。Su-Jin Baek：调查，数据管理。Dong Ryun Gu：调查，数据管理。Yu Jin Kim：调查，数据管理。Seong Cheol Kim：调查，数据管理。Sungwook Chae：调查，资金获取，数据管理。Taesoo Kim：监督，项目管理，资金获取。Ki Mo Kim：写作—审阅与编辑，监督。动物实验对象本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经韩国韩医学研究院机构动物护理和使用委员会批准。（批准号：22-073）资金本研究由韩国韩医学研究院、韩国教育科学技术部资助 [基金号：SSN2611020]。利益冲突声明作者声明，他们没有已知的可能影响本研究报告工作的竞争经济利益或个人关系。Ki-Shuk Shim|Hye Jin Kim|Su-Jin Baek|Dong Ryun Gu|Yu Jin Kim|Seong Cheol Kim|Sungwook Chae|Taesoo Kim|Ki Mo Kim