一种抗CD3ε单克隆抗体可实现对中国花鲈（Lateolabrax maculatus）T细胞活化和代谢重编程的表征

《Fish & Shellfish Immunology》：A monoclonal antibody against CD3ε enables characterization of T cell activation and metabolic reprogramming in Chinese seabass ( Lateolabrax maculatus)

　　

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  制备了一种针对中国花鲈LmCD3ε的单克隆抗体。
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  抗LmCD3ε单克隆抗体可特异性识别多个免疫相关组织中的CD3ε⁺ T细胞。
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  抗LmCD3ε单克隆抗体在体外诱导T细胞活化信号及糖酵解重编程。

引言

T细胞功能从根本上依赖于对抗原的精确识别以及随后受体触发的信号级联反应[1]。在此过程中，T细胞受体（TCR）首先识别肽-主要组织相容性复合体（pMHC）配体。CD3ε是TCR信号复合体的关键亚基，负责介导细胞内活化信号的转导[2], [3]。CD3ε在TCR-CD3复合体的组装及其在质膜上的稳定表达中发挥重要作用。当受体与配体结合后，其胞质结构域内的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）发生磷酸化，从而招募下游激酶并启动信号级联反应。最终，这些级联反应驱动T细胞的增殖、分化以及效应功能的获得[4], [5]。因此，CD3ε不仅是TCR介导的信号转导的重要组分，也是T细胞鉴定、定位和功能表征的重要分子标志物[6], [7]。尽管硬骨鱼类中基本的信号传导机制总体上是保守的，但在CD3ε的组织分布和表达模式上存在差异，这可能反映了其对不同生态环境和病原体压力的适应。例如，银鲫肾脏中CD3ε的基础表达相对较低，但在细胞活化后可显著增强[8]。相反，大西洋鲑肠黏膜中的CD3ε⁺ T细胞优先定位于后肠区域，表现出显著的组织驻留特征，并在抗原刺激后参与局部的黏膜免疫应答[9]。

鉴于CD3ε在TCR介导的抗原识别和信号转导中的核心作用，开发针对该分子的特异性单克隆抗体（mAb）为T细胞亚群的鉴定、分选和功能表征提供了关键技术基础[6]。然而，硬骨鱼类中CD3ε单克隆抗体的缺乏限制了T细胞的可靠鉴定和表征，阻碍了在细胞和机制水平上对T细胞功能的深入研究[10]。迄今为止，仅在少数硬骨鱼类物种中成功开发了单克隆抗体。在虹鳟中，CD3ε单克隆抗体已通过流式细胞术和显微镜技术实现了IgM^-CD3ε⁺淋巴细胞群体的鉴定和定位[11]。除鉴定外，来自大黄鱼的CD3ε单克隆抗体还被用于激活信号通路，包括雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）以及Ca²⁺流，从而为体外研究T细胞功能提供了实验方法[12]。利用罗非鱼的抗CD3ε和CD28单克隆抗体进行共刺激，进一步证明了将初级活化信号与共刺激信号整合对于T细胞的完全活化和增殖是必需的[13]。总的来说，抗CD3ε单克隆抗体可支持硬骨鱼类T细胞研究的多个方面，包括T细胞鉴定、体外活化和功能分析。

越来越多的证据表明，鱼类T细胞在硬骨鱼类的抗感染免疫应答中发挥重要作用[14], [15]。与哺乳动物不同，硬骨鱼类通常缺乏典型的淋巴结，相反，胸腺、头肾、脾脏以及黏膜相关淋巴组织（如鳃）是免疫应答的主要场所[8], [16]。与这种独特的免疫组织结构一致，在病原体感染或免疫刺激后，观察到CD3⁺ T细胞发生显著变化[17], [18]。在斑马鱼、银鲫和大西洋鲑中，感染后CD8⁺或CD8⁺CD3⁺细胞数量增加已有报道。这些证据共同表明，T细胞在硬骨鱼类抵抗病原体防御中具有重要意义[15], [19], [20], [21]。然而，可靠的抗CD3ε单克隆抗体的有限可用性仍然是经济鱼类中T细胞鉴定和功能表征的重要制约因素。

中国花鲈（Lateolabrax maculatus）是中国主要的海水养殖物种之一，具有产量高和商业价值大的特点[22]。然而，在集约化养殖条件下，其养殖常受到细菌性和病毒性疾病的影响[23], [24]。尽管T细胞介导的适应性免疫在抗感染防御和免疫稳态中发挥关键作用，但中国花鲈中T细胞的研究因缺乏针对CD3ε的特异性单克隆抗体而受到限制，从而无法进行其鉴定和功能表征[25]。中国花鲈和日本花鲈（Lateolabrax japonicus）在形态学和遗传学上高度相似，历史上被认为是同一物种[26], [27]。它们的线粒体基因组序列相似性高达91.3%[28]。在缺乏中国花鲈CD3ε序列的情况下，亲缘关系密切的日本花鲈的同源CD3ε序列可为引物设计和序列获取提供有用的参考。因此，可以设想，基于日本花鲈CD3ε序列设计的引物可用于从中国花鲈cDNA中扩增CD3ε序列。据此，拟开发针对中国花鲈CD3ε的单克隆抗体，并评估其在T细胞鉴定和功能分析中的潜在应用。利用该抗体，研究了CD3ε⁺细胞在中国花鲈组织中的分布以及与T细胞活化相关的下游信号事件。本研究有望为中国花鲈T细胞研究提供有价值的免疫学工具，并为深入理解硬骨鱼类的适应性免疫提供理论支持。

章节片段

实验动物

中国花鲈（L. maculatus）购自中国广东省广州市的一家养殖场。鱼只饲养在28°C的温控循环水养殖系统中，每日投喂商业颗粒饲料。经过两周的适应期后，选取体长为8至10厘米的个体用于实验。6周龄的BALB/c小鼠购自华东师范大学闵行实验动物中心。

抗LmCD3ε单克隆抗体的开发

对pMD19-T-LmCD3质粒进行测序，结果显示推导的氨基酸序列与中国花鲈注释的CD3ε蛋白序列完全一致，证实所克隆的序列对应于LmCD3ε。为制备抗CD3ε抗体，将全长LmCD3ε编码序列克隆到MIGR1逆转录病毒载体中，构建MIGR1-LmCD3ε，然后将其导入BOSC23包装细胞中以产生逆转录病毒颗粒（图1A）。流式细胞术证实

讨论

TCR-CD3复合体将抗原识别与细胞内信号传导有效偶联，对T细胞活化至关重要[32], [33]。在该复合体中，CD3ε既是T细胞鉴定的重要标志物，也是TCR介导的信号转导的关键组分。然而，抗CD3ε单克隆抗体的有限可用性限制了许多硬骨鱼类物种中T细胞的鉴定、分离和功能表征[11], [34]。这一挑战尤为突出

伦理声明

本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：中国科学技术部颁布的《实验动物饲养管理和使用指南》。本研究经华东师范大学实验动物伦理委员会批准。

利益冲突声明

作者声明无财务利益冲突。

作者贡献声明

Jingfeng Ding：调查、数据管理、撰写初稿。Yuying Zheng：数据管理、撰写初稿。Qiqi Jiang：调查、数据管理。Liuhua Qiu：调查。Kang Li：调查。Jialong Yang：经费获取、概念化、方法学。Xiumei Wei：概念化、方法学、监督、撰写—审阅与编辑、项目管理。

资助

本研究得到国家自然科学基金（42576117）的资助。

致谢

感谢华东师范大学生命科学学院的仪器共享平台（ECNU）提供的仪器共享服务，华东师范大学生命科学学院的流式细胞术核心设施（ECNU）提供的FACS分析，以及ECNU多功能创新平台（011）提供的动物饲养服务。

Jingfeng Ding|Yuying Zheng|Qiqi Jiang|Lihua Qiu|Kang Li|Jialong Yang|Xiumei Wei