多重基因缺失的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）菌株的构建及其对凡纳蛤（Litopenaeus vannamei）短期保护效果的初步评估

《Fish & Shellfish Immunology》：Construction of Multigene-Deletion Vibrio parahaemolyticus Strains and Preliminary Evaluation of Their Short-Term Protective Effects in Litopenaeus vannamei

　　

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  三基因缺失降低了Vibrio parahaemolyticus的毒力特征
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  基因表达分析与分泌和运动途径的减弱相关
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  减弱的菌株在太平洋白虾中的定殖能力降低
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  浸泡疫苗接种可提高白虾对Vibrio感染的存活率
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  减弱的菌株造成的组织损伤更小，且能引发更强的免疫反应

引言

由Vibrio物种引起的细菌性疾病仍然是全球虾类养殖业面临的主要挑战，特别是在集约化养殖条件下[1], [2]。频繁发生的弧菌病爆发导致了巨大的经济损失，并持续威胁着动物健康、生产效率以及水产养殖业的可持续性[3]。在主要虾类生产区，环境波动、高养殖密度和养殖相关压力进一步增加了宿主对Vibrio感染的敏感性，并加重了疾病的严重程度[4], [5], [6]。 在致病性Vibrio物种中，Vibrio parahaemolyticus是影响公共健康和海洋水产养殖最重要的细菌病原体之一[7]。在虾类养殖中，V. parahaemolyticus感染与肝胰腺损伤、生长性能下降和高死亡率相关[8], [9]。包括弧菌病在内的虾类疾病造成了巨大的经济损失，并威胁着水产养殖生产[10]。Vibrio parahaemolyticus是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，在海洋环境中广泛分布，并且经常在水产养殖系统中被检测到[11]。其致病性由多种毒力相关因子介导，包括溶血素、外膜蛋白、胞外酶、金属摄取系统[12], [13]，以及专门的分泌系统，如III型分泌系统（T3SS）[14]和VI型分泌系统（T6SS）[15]。这些因子共同导致了宿主定殖、组织损伤、免疫紊乱以及细菌在宿主体内的持续存在[16], [17], [18]。针对多个毒力相关基因可能同时减少多种致病特性，因此值得作为减毒策略进行评估[19]。

抗生素仍被普遍用于预防和控制虾类养殖中的V. parahaemolyticus感染。然而，其广泛且通常是预防性的使用加速了多重耐药Vibrio菌株在水环境中的出现和传播[20], [21], [22], [23]。这不仅降低了治疗效果，还引发了关于环境污染、药物残留和公共卫生风险的担忧。疫苗提供了一种替代的疾病预防方法，可能会减少水产养殖中的抗生素使用。近年来，灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和活减毒疫苗都被探索用于控制水生动物中的Vibrio感染[19], [24], [25], [26], [27], [28], [29]。然而，与脊椎动物相比，虾类疫苗的开发更具挑战性，因为对虾主要依赖于先天免疫反应。因此，疫苗诱导的保护通常被解读为免疫启动或增强的先天防御反应，而不是典型的适应性免疫[26], [30], [31], [32]。尽管如此，越来越多的证据表明，先前接触Vibrio抗原可以增强抗菌防御能力，并在L. vannamei二次感染后提高存活率[26], [30]，这支持了基于疫苗的预防在虾类养殖中的可行性。活减毒疫苗保留了广泛的天然抗原，并能模拟自然感染的部分过程[19], [29]。此外，活减毒菌株可能更适合在高密度养殖条件下饲养的小型水生动物的实际应用策略[31], [32]。一项先前的研究表明，删除V. parahaemolyticus中的lpxD基因可以在保持L. vannamei免疫保护潜力的同时降低细菌的毒力[19]。自然存在的V. parahaemolyticus变异体可以保留pirAB基因而不引起急性肝胰腺坏死病（AHPND），表明这些基因的存在本身并不足以建立致病性[33]。 这三个目标基因的选择是因为它们代表了不同的毒力相关功能。hlyd预计编码一种参与分泌相关过程的膜相关成分，而hlyIII编码一种与膜损伤和溶血活性相关的溶血素III家族蛋白。ompn编码一种外膜孔蛋白，与细菌生理、运动性、宿主相互作用和毒力相关表型有关。基于之前的单基因研究及我们的早期观察，我们假设结合溶血素相关基因的缺失与外膜蛋白基因的缺失可以同时减少多种毒力相关特性，而不会完全抑制细菌生长。由于没有包括互补菌株，这一理由代表了菌株设计的基础，而不是证明每个基因的单独贡献。

尽管如此，开发针对V. parahaemolyticus的活减毒疫苗仍面临若干重要挑战，包括确保足够的减毒效果、遗传稳定性、生物安全性和在水产养殖条件下的有效保护[32], [34]。特别是，关于多毒力基因缺失菌株及其在虾类中的免疫保护效果的系统研究仍然有限。这些空白需要评估多基因缺失的V. parahaemolyticus菌株作为活减毒疫苗候选者的潜力。 在本研究中，我们通过同源重组构建了V. parahaemolyticus的Δhlyd-hlyIII和Δhlyd-hlyIII-ompn突变体，并检测了它们的生长和毒力相关表型。我们通过RNA-seq比较了WT株和三基因缺失菌株，在T. thermophila共培养中评估了它们的反应，并测量了L. vannamei暴露后菌株在组织中的细菌负荷。我们还评估了剂量-死亡率关系、两次浸泡后的免疫相关基因表达，以及WT菌株挑战前后的存活率。

章节片段

Litopenaeus vannamei, Tetrahymena thermophila, 细菌菌株和质粒

临床健康的Litopenaeus vannamei（体长约4厘米）从中国江苏省如东的一个商业池塘中获得。运输后，虾被维持在通气的人工海水中直至挑战实验。无法从现有记录中准确得知其适应时间，死亡的个体被及时移除。培养水通过将海盐溶解在自来水中制备，最终盐度为5实用盐度单位（PSU）。

构建Vibrio parahaemolyticus的Δhlyd-hlyⅢ和Δhlyd-hlyⅢ-ompn突变体

我们之前的研究表明，删除该菌株中的单个毒力相关基因可以降低细菌的毒力[37], [38], [39]。为了进一步减弱菌株的毒力，我们依次删除了其他毒力相关基因。通过同源重组构建了Δhlyd-hlyIII和Δhlyd-hlyIII-ompn突变体。PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳显示了两种突变体预期的缺失相关条带图案（图1A,B）。

讨论

我们构建了Δhlyd-hlyIII和Δhlyd-hlyIII-ompn突变体，以研究联合基因缺失对V. parahaemolyticus表型和减毒效果的影响。这两种突变体在测试条件下保持了生长，并显示出毒力相关特性的降低。这种方法扩展了先前关于多基因缺失用于活减毒疫苗开发的研究[19], [29]。由于没有包括互补菌株，因此每个缺失基因的贡献尚不确定。

结论

Δhlyd-hlyIII-ompn突变体在测试条件下保持了生长，并显示游泳运动能力、胞外蛋白酶和溶血活性降低，生物膜形成减少，以及组织细菌负荷降低。探索性RNA-seq鉴定了2,391个候选DEGs；经过多次测试校正后，ABC转运蛋白和鞭毛组装基因在下调基因中仍显著富集。估计的7天浸泡LD₅₀为>1.00 × 10⁹ CFU/mL。

CRediT作者贡献声明

Liu：概念化、方法论、软件和写作——初稿撰写；正式分析和可视化、验证、调查和数据整理。

Jinyuan Che：概念化、方法论和初稿撰写

Shaojie Hu：概念化、方法论和数据整理。

Qitong Fang：方法论和数据整理。

Heng Xu：资源提供。

Baolong Bao：资金获取、资源提供、监督、审稿和编辑。

数据可用性

WT株和Δhlyd-hlyIII-ompn菌株的RNA-seq读取文件已提交至NCBI序列读取档案（SRA），BioProject访问号为PRJNA1529203。支持本研究发现的其他数据可向相应作者请求获得。

手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了Chat GPT/Gemini来纠正语法错误和提高句子准确性。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的会影响到本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了岳qing市河流和湖泊洄游鱼类资源专项调查（25FW044）的支持。

Zhuochen Liu|Jinyuan Che|Shaojie Hu|Qitong Fang|Heng Xu|Baolong Bao