适配体鸡尾酒靶向大肠杆菌O157的竞争性结合机制：来自分子对接和动力学模拟的见解

《Food Bioscience》：Competitive Binding Mechanisms in Aptamer Cocktails Targeting Escherichia coli O157: Insights from Molecular Docking and Dynamics Simulations

　　通过表位重叠研究Apt4介导的潜在竞争。通过靶向不同的细菌蛋白观察协同识别。通过对接和分子动力学模拟建模蛋白-适配体相互作用。建议表位兼容性优于单个适配体亲和力。为合理设计适配体鸡尾酒提供框架。引言食源性疾病影响全球超过6亿人，每年导致超过42万人死亡。在致病病原体中，产志贺毒素大肠杆菌O157（STEC O157，以下简称大肠杆菌O157）因其极低的感染剂量和严重的临床结局，包括出血性结肠炎和溶血性尿毒症综合征（HUS），而受到特别关注（Hao et al., 2023）。大肠杆菌O157的传播主要是食源性，常与受污染的碎牛肉、乳制品和新鲜农产品相关，需要快速可靠的分析工具用于食品质量控制和公共卫生保护（Pang et al., 2024）。因此，快速、灵敏地检测大肠杆菌O157对于预防食源性疫情和保护公共卫生至关重要。当前技术如聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）广泛使用，但存在固有局限性（Shi et al., 2026）。PCR耗时，需要专业知识和训练有素的人员，并且易受污染导致的假阳性结果。ELISA虽然在实验室环境中稳健，但依赖热稳定性有限且储存条件严格的抗体，限制了其在快速现场食品质量控制中的应用。这些局限性推动了替代性分子识别元件的开发。适配体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）产生的单链核酸配体，具有优于抗体的几个优点，包括高亲和力、简便的化学合成、优异的物理化学稳定性和灵活的化学修饰。SELEX由Ellington和Szostak（1990）以及Tuerk和Gold（1990）独立建立，通过迭代选择和扩增循环，从大型随机寡核苷酸文库中分离高亲和力RNA配体。在另一项研究中，Ellington和Szostak（1992）进一步将该方法扩展到选择折叠成特定配体结合结构的单链DNA分子，将SELEX的适用性扩展到DNA适配体。然而，由于选择条件通常与实际检测环境不同，单个适配体在细菌识别中经常表现出次优性能。为了解决这一限制，各种优化策略，包括序列截短、适配体工程和多适配体组合组装，已被探索，其中适配体鸡尾酒已成为一种特别有前景的方法（Zhu et al., 2024; Liu et al., 2025; Liu et al., 2026）。细菌表面结构复杂，由外膜蛋白、脂多糖、菌毛和其他暴露组分组成。不同的SELEX策略因此可以生成识别同一细菌细胞上不同表位的多个适配体，为构建具有增强识别能力的多价适配体鸡尾酒提供机会。这种多价系统有望通过同时识别多个表面受体来提高结合亲和力、特异性和检测可靠性，用于食源性病原体的检测。事实上，Kim等人（2014）证明，结合三种大肠杆菌适配体使荧光信号增加超过100%，并将检测限提高了18倍，与单个适配体相比。随后，针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和支原体的鸡尾酒也报道了类似的增强（Wan et al., 2020; Li et al., 2021; Rani et al., 2026）。尽管有这些有前景的发现，但适配体鸡尾酒的机制研究仍然很少。现有报告主要关注多价适配体改进的分析性能，而其协同或拮抗行为背后的分子基础在很大程度上未被探索。特别是，不清楚多种适配体的效果是否总是加性或协同，或者高亲和力适配体是否总是对鸡尾酒性能有积极贡献。在我们的初步研究中，我们观察到一个反直觉现象：尽管Apt4作为单个适配体表现出最高亲和力，但其加入却持续降低鸡尾酒的整体结合性能。这一观察表明，某些适配体组合可能经历非加性竞争性结合，要么通过识别细菌表面重叠或空间相邻的表位，要么通过Apt4诱导的受体蛋白构象变化（由于其非特异性或多靶点结合），从而阻止其他适配体结合。此外，Apt4的内在结构可能与其余三个适配体发生静电相互作用。我们提出这种竞争效应可能损害多价识别的优势，从而使高性能适配体鸡尾酒的合理设计复杂化。为了探索这些提议机制中的竞争假设，有必要使用超越常规亲和力测量的方法来研究这些竞争性相互作用的分子基础。计算方法，特别是分子对接和分子动力学（MD）模拟，提供了在原子分辨率下预测适配体-受体相互作用的强大工具（Huang et al., 2025）。例如，Wang等人（2025）最近使用共免疫沉淀/质谱法鉴定了布鲁氏菌的表面靶标BamA，随后通过分子对接和MD模拟提出了其与适配体的结合机制，为机制研究提供了有价值的框架。在本研究中，我们通过整合流式细胞术、共聚焦激光扫描显微镜、分子对接和分子动力学模拟，结合实验验证和计算分析，系统研究了大肠杆菌O157最佳三适配体鸡尾酒背后的可能分子识别模型。我们首先评估了不同适配体组合的结合性能，并确定了最佳三适配体鸡尾酒。随后，构建了适配体及其相应受体蛋白的三维结构模型，以识别其结合位点并研究鸡尾酒中适配体之间的潜在竞争。通过探索适配体之间协同和竞争的结构基础，这项工作为多价适配体识别提供了计算见解，并为食品分析中细菌检测的高性能适配体鸡尾酒合理设计提供了理论框架。章节摘录材料与菌株磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。所有DNA适配体由生工生物工程合成，经高效液相色谱（HPLC）纯化，并在5′端标记6-羧基荧光素（FAM）、花菁3（Cy3）或花菁5（Cy5）。Apt1、Apt2、Apt3和Apt4最初分别由Wu等人（2012）、Bruno等人（2010）、Wu等人（2015）和Yu等人（2018）报道。适配体的序列单个适配体和适配体鸡尾酒的比较亲和力为了研究结合不同适配体是否能增强细菌识别，通过流式细胞术测量了四个单个ssDNA适配体、六个二元鸡尾酒和四个三元鸡尾酒对大肠杆菌O157的结合性能。如图2A所示，Apt1和Apt4单独测试时表现出相当的荧光强度。在二元组合中，Apt1+2产生最强荧光信号，而Apt3+4最弱。对于三元结论在本研究中，我们通过整合流式细胞术、共聚焦激光扫描显微镜、分子对接和分子动力学模拟，系统研究了靶向大肠杆菌O157的适配体鸡尾酒性能的分子基础。流式细胞术显示，三元鸡尾酒Apt1+2+3表现出显著增强的结合亲和力和特异性，可归因于其对三个空间上不同的表面受体（一种脂蛋白、OmpF和CRediT作者贡献声明Chengbao Huang：可视化、验证、数据管理、概念化。Lingyan Cheng：可视化、验证、软件、调查。Jie Wang：可视化。Xiang Fang：可视化。Ruiyuan Shi：写作-审阅与编辑、写作-初稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Li Wang：可视化、验证、资源、项目管理、资金获取、概念化。Xiaoling未引用文献Liu et al., 2025.数据可用性数据将应要求提供。利益冲突声明作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，可能影响本论文所报告的工作。致谢本工作由广东省重点领域研发计划（批准号2025B0202120003）和国家自然科学基金（批准号32572521）资助。Ruiyuan Shi|Xiaoling Cao|Jiajian Liang|Chengbao Huang|Lingyan Cheng|Xiaonan Wang|Zhao Tu|Likai Hu|Qiyun Qian|Jinwei Li|Jie Wang|Xiang Fang|Li Wang