《Food Chemistry》：Development of an efficient β
-N-acetylhexosaminidase with elevated transglycosylation activity: A synergy of experimental validation and computational simulations
编辑推荐：
•开发了一种高效的HSaaS策略用于β-N-乙酰氨基己糖苷酶工程改造。•获得了一个突变体，其时空产率（174.0 g/L/h）比野生型高3.0倍。•该突变体的转糖基/水解比（T/H比）提高了2.2倍，而其水解催化效率kcat/Km下降了3.1倍。•该突变体的转糖基产物达到29.0
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开发了一种高效的HSaaS策略用于β-N-乙酰氨基己糖苷酶工程改造。
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获得了一个突变体，其时空产率（174.0 g/L/h）比野生型高3.0倍。
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该突变体的转糖基/水解比（T/H比）提高了2.2倍，而其水解催化效率kcat/Km下降了3.1倍。
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该突变体的转糖基产物达到29.0 g/L，为迄今最高水平。
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首次利用DFT和MD阐明了转糖基活性提高的机制。
引言
已有研究证明，N-乙酰壳寡糖（几丁质的衍生物）具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗菌和免疫调节作用（Liu et al., 2019; Liu et al., 2023; Xu et al., 2017; Yu et al., 2024）。N-乙酰壳寡糖的聚合度（DP）显著影响其生物活性，较高的DP值与其更强的生物多样性相关（Deng et al., 2020）。例如，N-乙酰壳三糖[(GlcNAc)3]已被证明可作为溶菌酶的竞争性抑制剂，从而抑制其在心肌组织中的活性并预防脓毒症（Mink et al., 2004）。类似地，N-乙酰壳四糖[(GlcNAc)4]在固氮细菌与豆科植物的共生关系中起着关键作用（Winkler et al., 2017）。几丁质酶独特的催化机制主要产生N-乙酰壳二糖[(GlcNAc)2]和N-乙酰-d-氨基葡萄糖（GlcNAc）。然而，(GlcNAc)2已被证明缺乏这些生物活性。因此，寻找替代酶用于制备高聚合度N-乙酰壳寡糖尤为重要。
β-N-乙酰氨基己糖苷酶（EC 3.1.2.52）是一种具有转糖基活性的酶，用于生产高聚合度N-乙酰壳寡糖（Bojarová et al., 2019）。然而，大多数β-N-乙酰氨基己糖苷酶通常使用化学合成底物来生产高聚合度N-乙酰壳寡糖，仅有少数研究使用天然底物（Liu et al., 2023）。例如，来自米曲霉（Aspergillus oryzae）的AoHex以(GlcNAc)2为底物生产(GlcNAc)3和(GlcNAc)4（Muschiol et al., 2020）。值得注意的是，这些酶通常表现出较低的转糖基活性和较差的转糖基与水解选择性，严重限制了其工业应用（David et al., 2017; Olvera et al., 2012; Osanjo et al., 2007）。为了克服这一瓶颈，理性蛋白质工程结合高通量筛选高活性转糖基突变体已成为酶工程的研究热点（Andre-Miral et al., 2015; Yang et al., 2024）。为了增强转糖基活性并提高产物产量，已提出多种策略。修饰+1亚位点并增强催化沟槽内的疏水微环境可以限制水分子的参与，从而最大程度抑制水解反应。例如，对野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）α-葡萄糖苷酶（XgtA）的+1亚位点进行修饰，产生了突变体L145I和S272T，转糖基活性提高了45%（Chen et al., 2022）。此外，先前的研究表明，修饰?1亚位点可以有效 destabilize 水解过渡态，从而增强转糖基活性（Bissaro et al., 2015; Vega et al., 2025）。例如，对干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）GH29 α-L-岩藻糖苷酶（AlfB）?1亚位点的保守残基H80进行突变，将T/H比从0.29提高到1.89，转糖基产率从18%提高到57%（Teze et al., 2021）。同时，增加酶与底物之间的局部浓度和结合效率也被证明可以提高转糖基活性（Zou et al., 2022）。此外，引入芳香族氨基酸残基可有效增强转糖基活性，这些残基通过π-π堆积相互作用增强了对糖苷的亲和力（Mészáros et al., 2022）。总之，目前提高β-N-乙酰氨基己糖苷酶转糖基活性的策略主要集中在增强疏水性以抑制水解（Liu et al., 2023）。然而，通过修饰提高β-N-乙酰氨基己糖苷酶对天然底物转糖基活性的研究仍然有限。将增强催化沟槽内疏水微环境与改善底物结合能力相结合的研究更为少见。
传统实验方法在捕捉酶催化过程中发生的瞬态构象变化和能量传递过程方面存在局限性。计算生物学技术的出现，包括分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT），使得在原子水平上详细阐明酶催化机制成为可能（Jitonnom et al., 2015; Zheng et al., 2024）。实验验证与计算建模的协同整合，使得高效筛选高活性突变体并精确阐明突变、结构与功能之间的构效关系成为可能，从而为合理设计高效转糖基酶提供了理论基础。然而，通过实验与计算相结合的方法协同增强β-N-乙酰氨基己糖苷酶转糖基活性的研究仍然有限。
在前期研究中，我们鉴定了一种来自嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的GH20 β-N-乙酰氨基己糖苷酶（SmNag86）（Sun et al., 2026）。该酶具有产生(GlcNAc)3的转糖基活性；然而，(GlcNAc)3的低产率（32.8%）限制了其工业应用。本研究开发了疏水和底物结合氨基酸扫描（HSaaS）策略以提高转糖基活性，以β-N-乙酰氨基己糖苷酶SmNag86为模型酶。聚焦突变筛选过程实现了催化沟槽内关键位点的精确定位。此外，利用MD模拟和DFT计算阐明了突变诱导的构象和能量变化。本研究为β-N-乙酰氨基己糖苷酶提供了一种有效的工程策略，阐明了转糖基活性增强的机制，并确定了用于在食品、化工和农业工业中生产高聚合度N-乙酰壳寡糖的有前景的候选酶。
章节片段
材料
粉末状几丁质、牛血清白蛋白（BSA）和p-硝基苯基-N-乙酰氨基葡萄糖（pNP-GlcNAc）购自Sigma公司（美国）。胶体几丁质和(GlcNAc)2按先前报道的方法制备（Yang et al., 2016）。N-乙酰-d-氨基葡萄糖和聚合度为2–4的N-乙酰壳寡糖标准品购自青岛博智寡糖生物技术有限公司（中国）。
聚焦突变策略
对酶-底物复合物进行了20 ns的MD模拟以获得其稳定构象（Zhang et al., 2025）。
增强转糖基活性的HSaaS策略
通过引入催化沟槽内的疏水微环境已被证明可以增强转糖基活性（Van Der Veen et al., 2001）。然而，在转糖基增强研究中，底物结合亲和力经常被忽视（Vega et al., 2025; Yang et al., 2026）。因此，我们开发了一种将催化沟槽内疏水微环境与底物亲和力改善相结合的策略，作为指导
结论
本研究以来自嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的β-N-乙酰氨基己糖苷酶为模板，基于HSaaS策略构建了聚焦突变文库。突变体SmNag86-S436V表现出显著增强的(GlcNAc)3产量，转化率达到48.3%（29.0 g/L），较野生型酶有大幅提高。与野生型相比，SmNag86-S436V的T/H比提高了2.2倍，时空产率提高了3.0倍，同时
CRediT作者贡献声明
孙广如：撰写–初稿，方法学，数据管理。 王天宇：方法学，调查，数据管理。 赵清璇：数据管理。 刘雪静：数据管理。 安瑞丽：数据管理。 王春玲：撰写–审阅与编辑。 路福平：监督。 刘逸寒：撰写–审阅与编辑，方法学。 刘义浩：撰写–审阅与编辑，监督，经费获取。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，可能影响本论文所报告的工作。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（No. 22308258）和天津市科技计划项目（No. 25YDTPJC00720）的资助。
孙广如|王天宇|赵清璇|刘雪静|安瑞丽|王春玲|路福平|刘逸寒|刘义浩
