碱性蛋白酶处理的酵母蛋白水解物的结构与功能特性及其在磅蛋糕中作为鸡蛋替代品的应用

《Food Chemistry》：Structural and functional properties of alkaline protease-treated yeast protein hydrolysates and their application as egg substitutes in pound cake

　　碱性蛋白酶诱导酵母蛋白性质发生时间依赖性变化。水解降低了颗粒尺寸，并使β-折叠向β-转角结构转变。溶解度从4.4%提高至37.6%，同时起泡性能得到改善。乳化活性呈非线性变化，所有样品均出现明显的分层现象。酵母蛋白水解物在磅蛋糕中展现出作为鸡蛋替代品的初步潜力。引言蛋白质是人体组织和器官的重要组成部分，充足的膳食蛋白质摄入对于维持正常生理功能至关重要。随着全球人口的快速增长和可持续发展需求的日益提高，传统的动物源性蛋白质资源正面临巨大的供应压力和环境挑战，因此开发新型替代蛋白质成为食品科学的重要研究方向（Akharume等，2021）。在各种替代蛋白质来源中，酵母蛋白（YP）作为一种微生物来源的高品质蛋白质，因其环境可持续性和高生物利用度而备受关注，被认为是一种有前景的替代蛋白质来源。酵母蛋白具有很高的营养价值，含有18种蛋白氨基酸，其中包含8种必需氨基酸和2种半必需氨基酸。必需氨基酸占总量的43.9%，超过了联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的40%质量基准（Ma等，2023；Min等，2024）。然而，酵母蛋白富含疏水性氨基酸残基和含硫氨基酸。在热处理过程中，蛋白质变性会促进由疏水相互作用和二硫键交联驱动的分子间聚集，形成溶解性差的致密聚集体。这一局限性严重限制了酵母蛋白的乳化活性和起泡能力等关键功能特性，成为酵母蛋白在食品加工中更广泛应用的主要瓶颈（Ma等，2023）。酶解是改善蛋白质功能特性的有效策略。肽主链的裂解将蛋白质降解为更小的多肽和寡肽，同时伴随构象变化，如有序二级结构的破坏以及疏水基团的暴露和再包埋。这些结构修饰，连同二硫键的断裂和重排，共同改变了蛋白质的溶解性和表面活性（Li等，2024；Liu等，2019）。已有研究表明，适度水解可显著提高蛋白质的溶解性和起泡能力（Lyu等，2023；Shay等，2023），而过度水解可能产生大量低分子量短肽，破坏亲水-疏水平衡，从而降低乳化活性和泡沫稳定性（Ghribi等，2015；Severin & Xia，2006）。此外，蛋白质对酶解的反应高度依赖于底物，因为其固有的亚基组成、二硫键含量和聚集状态共同决定了水解时表面疏水性和功能特性的变化。这一点已在对水解豌豆蛋白（Shuai等，2022）、蚕豆蛋白（Liu等，2019）、大麻籽蛋白（Yin等，2008）和米谷蛋白（Xu等，2016）的研究中得到证实。不同的蛋白酶由于底物特异性和切割位点偏好的差异，会产生不同的蛋白质结构修饰和功能结果（Akharume等，2021）。酵母蛋白是一种异质且聚集的蛋白质材料，而非具有单一明确氨基酸序列的纯化蛋白质（Ma等，2023）。因此，选择碱性蛋白酶是因为其具有广泛的内肽酶活性，适合切割不同蛋白质组分中的内部肽键，并在温和碱性条件下产生可控的结构修饰。在一项相关研究中，Min等（2024）研究了不同Alcalase/Prozyme 2000P组合处理的酵母蛋白，并报告了颗粒尺寸、形态、表面疏水性、溶解性和乳化特性的变化。然而，他们的研究侧重于复合酶处理之间的终点比较，并未考察单一碱性蛋白酶产生的时间依赖性结构和功能变化，也未涉及水解物在食品体系中的应用。蛋糕是全球消费最广泛的烘焙食品之一。其中，磅蛋糕以其面粉、鸡蛋、黄油和糖等比例配制的经典配方为特征，具有细腻的碎屑结构和光滑的口感，对原料的功能性提出了严格要求（Yazici & Ozer，2021）。鸡蛋是磅蛋糕中不可或缺的多功能性原料。蛋清蛋白具有优异的起泡性能，能够在搅打过程中包裹和稳定气泡，而蛋黄中的脂蛋白和磷脂则为面糊提供良好的乳化性能。在烘焙过程中，蛋清和蛋黄蛋白发生变性和交联形成凝胶网络，为蛋糕提供结构支撑并防止冷却时塌陷（Paraskevopoulou等，2015）。然而，对鸡蛋过敏、膳食胆固醇限制、纯素需求以及价格波动等担忧，推动了人们对开发鸡蛋替代策略的日益关注（Hedayati等，2022）。已有研究探索了使用植物源和动物源蛋白在蛋糕体系中部分替代鸡蛋（Liang等，2024；Paraskevopoulou等，2015）。然而，植物蛋白通常与致敏性和异味相关，而动物蛋白仍受可持续性问题的限制。与这些传统蛋白质来源相比，酵母蛋白不含豆腥味且非动物来源。如果通过酶促修饰能有效改善其功能特性，酵母蛋白可能成为磅蛋糕中鸡蛋替代的有前景选择。迄今为止，酵母蛋白或其水解物作为磅蛋糕中鸡蛋替代品的应用鲜有探索。在本研究中，通过碱性蛋白酶水解30、60、120和180分钟对酵母蛋白进行改性，获得具有不同水解度的酵母蛋白水解物（YPHs）。系统研究了酵母蛋白水解物的结构和功能特性，以阐明结构变化如何转化为功能性能。此外，使用酵母蛋白和酵母蛋白水解物替代磅蛋糕中50%的鸡蛋，并评估了它们对面糊密度以及磅蛋糕物理和质构特性的影响。假设碱性蛋白酶水解诱导的酵母蛋白结构修饰调控分子间相互作用，从而影响粒径分布、表面电荷，并最终影响酵母蛋白水解物在磅蛋糕体系中的功能特性和应用性能。章节摘要材料酵母蛋白（YP，#F80）购自安琪酵母股份有限公司（中国宜昌）。根据制造商提供的信息，酵母蛋白干基含78.2%蛋白质、4.8%灰分、2.32%水分和4.9%总碳水化合物。碱性蛋白酶（#JAO192，≥200 U/mg）由合肥博美生物科技有限公司（中国合肥）提供。所有其他化学品和试剂均为分析纯。酵母蛋白水解物的制备酵母蛋白水解物（YPH）的制备基于Zhang等（2023）的方法，略有改动。水解度水解度（DH）直接影响水解物的功能特性，并受蛋白酶类型和浓度、温度、pH等因素的影响（Fu等，2020）。如图1(a)所示，在30–180分钟的水解时间内，DH从4.73%逐渐增加到14.31%，所有组间差异显著（p < 0.05）。然而，随着反应时间的延长，DH的增加速率明显减慢，增量逐渐减小。结论碱性蛋白酶水解逐渐改变了酵母蛋白的结构，表现为粒径减小、向低分子量区域重新分布、β-折叠向β-转角构象转变以及表面疏水性降低。这些变化伴随着溶解性和起泡性能的显著改善，而乳化活性指数（EAI）随水解时间呈非线性变化，所有乳液均表现出快速相分离。在测试的50%鸡蛋替代水平下，酵母蛋白/酵母蛋白水解物CRediT作者贡献声明孙莎莎：写作——初稿、验证、调查、正式分析。李佳丽：验证、方法学、调查、正式分析。石俊哲：方法学、调查。王慧：方法学。吴芳华：方法学。朱培磊：方法学、概念化。王明春：写作——审阅与编辑、写作——初稿、监督、资源、项目管理、资金获取、概念化。陈宝明：方法学。白胜月：方法学。宋欣媛：未引用文献Vorob'ev, 2022利益冲突声明作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，可能影响本论文所报告的工作。致谢本工作得到安徽省自然科学基金资助（2308085MC106）。作者感谢IQC（上海）有限公司分享鸡蛋替代概念并提供原料选择建议。我们非常感谢审稿人提出的宝贵意见。孙莎莎|李佳丽|石俊哲|王慧|吴芳华|朱培磊|王明春|陈宝明|白胜月|宋欣媛