《PLOS Pathogens》：Validation of EUCAST 2026 breakpoints for Brucella species using routine laboratory methods: A comprehensive French National Reference Centre study
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布鲁氏菌病由细菌属布鲁氏菌属（Brucella）的多种菌种引起，在世界许多地区构成重大全球健康负担。欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）近期为布鲁氏菌属制定了标准化的临床折点（版本16.1，2026年），以支持全球监测和循证治疗。本研究利用常规实验室方
布鲁氏菌病由细菌属布鲁氏菌属（Brucella）的多种菌种引起，在世界许多地区构成重大全球健康负担。欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）近期为布鲁氏菌属制定了标准化的临床折点（版本16.1，2026年），以支持全球监测和循证治疗。本研究利用常规实验室方法，在一个大型国家参考菌株库中验证EUCAST 2026折点。研究人员回顾性分析了2017年1月至2026年6月期间法国国家参比中心（French National Reference Centre）的234株布鲁氏菌分离株，使用MALDI-TOF质谱和多重PCR进行菌种鉴定，并根据EUCAST指南使用E-test试条和纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验（AST）。羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）占主导地位（n=210，89.7%），另有少量猪种、牛种和亚马逊种布鲁氏菌。所有234株分离株对八种受试抗生素均表现为普遍敏感。值得注意的是，49.6%的分离株利福平最低抑菌浓度（MICs）位于EUCAST流行病学临界值（ECOFF）的两个倍比稀释度以内，强调需要持续监测该属利福平敏感性。链霉素评估出现一个关键的方法学发现：E-test试条提示很大比例分离株链霉素MIC升高，且不同批次结果一致；然而，对相同分离株进行的纸片扩散法显示全部234株均普遍敏感，抑菌圈直径范围为21–35 mm。本研究验证了在采用适当常规实验室方法时，EUCAST 2026折点在临床上适用且流行病学上合理。纸片扩散法应被视为布鲁氏菌属链霉素敏感性测定的参考方法。这些发现为临床微生物学实验室提供了重要的实用指导，表明法国仍无抗菌药物耐药性，并支持标准化AST检测以优化全球地方性和非地方性地区人类布鲁氏菌病的治疗管理。
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucella）多种菌种引起的人畜共患感染，全球每年发病估计为243万至745万例，在地中海盆地、中东、中亚、非洲和中南美洲流行。法国每年报告少于50例且多为输入性病例，但旅行与贸易使非流行地区同样面临输入耐药菌株风险。当前WHO和CDC推荐以多西环素联合利福平为基础方案，链霉素、庆大霉素等作为替代。然而，全球不同地区陆续出现尤其利福平和复方磺胺甲噁唑的耐药报告，且布鲁氏菌耐药机制复杂，包括外排泵、靶位突变和酶修饰等，因此需要标准化的药敏试验（AST）方案和明确临床折点。EUCAST于2026年（版本16.1）首次建立布鲁氏菌临床折点，但该折点是否适用于临床微生物实验室常规方法仍需验证。本研究即在此背景下，利用法国国家参比中心2017–2026年收集的234株布鲁氏菌，验证EUCAST 2026折点的临床适用性与流行病学合理性，并评估法国布鲁氏菌分离株的耐药现状。
研究人员采用法国国家参比中心2017年1月至2026年6月连续收到的234株布鲁氏菌分离株进行回顾性观察研究；菌种来源以血液培养和骨关节标本为主，65.4%来自非洲。菌种鉴定采用MALDI-TOF质谱和多重PCR（Bruce-ladder），猪种生物变种用Suis-ladder进一步区分。AST采用E-test试条测定九种抗生素MIC，并按EUCAST指南进行纸片扩散法；链霉素同时用另一厂家E-test和纸片扩散法复核。药敏培养基为添加5%脱纤维马血和20 mg/L β-NAD的MH-F琼脂，35±1°C、5% CO
2培养48小时；EUCAST 2026折点判读，并以ATCC质控菌株进行质量控制。统计分析采用Kruskal-Wallis H检验和Bonferroni校正的Mann-Whitney U检验。
菌株收集与菌种分布。法国国家参比中心共分析234株连续分离株，羊种布鲁氏菌占绝对优势（n=210，89.7%），其次为猪种（n=15，6.4%）、牛种（n=5，2.1%）和亚马逊种（n=4，1.7%）。49.6%的菌株来自血培养，9.4%来自骨关节标本；地理来源以非洲为主（65.4%，阿尔及利亚83株、突尼斯29株），中东占12.4%，欧洲占12.4%，亚洲和南美洲各占3.4%和2.3%。法国本土及海外领地来源菌株覆盖全部牛种、部分猪种生物变种及全部亚马逊种，体现了法国输入性病例和海外领地的地方流行特征。
总体抗菌药物敏感性试验结果。八种抗生素的MIC分布均呈野生型特征：头孢曲松0.032–2 mg/L，环丙沙星0.125–0.5 mg/L，左氧氟沙星0.125–1 mg/L，庆大霉素0.064–0.5 mg/L，四环素0.032–0.25 mg/L，多西环素0.032–0.25 mg/L，利福平0.25–2 mg/L，复方磺胺甲噁唑0.016–0.125 mg/L。按照EUCAST ECOFF判读，全部234株均敏感，未检出耐药。研究人员进一步分析MIC位于ECOFF两个稀释度以内的菌株比例：利福平最高（49.6%，MIC 2–4 mg/L），庆大霉素为35.9%，复方磺胺甲噁唑为15.4%，左氧氟沙星为9.0%，多西环素为8.5%，头孢曲松为0.9%，环丙沙星和四环素为0%。该结果提示利福平是最需要持续监测耐药趋势的药物。
菌种特异性药敏特征。非参数统计显示，八种抗生素中七种的MIC分布在四种布鲁氏菌间存在显著差异，仅复方磺胺甲噁唑分布均一（Kruskal-Wallis，p=0.435）。羊种布鲁氏菌对多数药物表现出最高的中位MIC且分布集中，支持其作为EUCAST折点开发的参考菌种。猪种和牛种MIC谱总体相似，多数成对比较无显著差异；猪种变异最大，尤其在利福平和左氧氟沙星。亚马逊种对头孢曲松中位MIC较高（0.875 mg/L vs 羊种0.38 mg/L），但Bonferroni校正后不显著，且所有MIC仍在敏感范围。
链霉素药敏检测。E-test初步检测150株中有12株（8.0%）链霉素MIC高于EUCAST ECOFF；使用另一厂家不同批次试条重复后结果一致，排除批次或厂家缺陷。相同菌株的纸片扩散法则显示全部234株抑菌圈直径为21–35 mm，均达到≥15 mm的敏感标准，表现为普遍敏感。抑菌圈直径在四种菌种间存在显著异质性（Kruskal-Wallis H=9.698，p=0.021），羊种中位直径最小（25 mm），与猪种和亚马逊种差异显著。研究人员认为E-test对链霉素存在布鲁氏菌属特异的假性MIC升高，可能与链霉素在含马血和β-NAD的MH-F琼脂中扩散不良有关，因此推荐纸片扩散法作为布鲁氏菌链霉素敏感性测定的方法。
讨论部分指出，布鲁氏菌耐药机制复杂，涉及RND型外排泵、rpoB/folA/folP/dhfr/gyrA/gyrB靶位突变、氨基糖苷修饰酶以及VirB分泌系统限制药物渗透等。本研究全部菌株敏感，优于地方性流行区，但对利福平MIC接近ECOFF的49.6%需持续关注；按CLSI判读，部分菌株会被归为中介，而EUCAST折点≤2 mg/L在临床上仍然适用。链霉素E-test假性升高对资源有限地区尤其重要，若不作方法学校正，可能产生错误的氨基糖苷耐药报告。研究局限包括牛种和亚马逊种样本量小、菌株地理来源偏倚、采用梯度扩散而非ISO 20776-1肉汤微量稀释。未来应开展多中心肉汤微量稀释验证链霉素差异，对ECOFF邻近的利福平MIC菌株进行全基因组测序，并通过国际联合菌株库建立非羊种布鲁氏菌的菌种特异ECOFF。
结论：这项对234株布鲁氏菌分离株的综合分析支持三点实用结论。EUCAST 2026折点在常规临床实验室中可行，并能正确地将一个全部为野生型的国家菌株库分类，这是任何新折点必须满足的首要条件。然而，生成MIC的方法并非中性：就链霉素而言，梯度扩散和纸片扩散对同一菌株给出不同的敏感性类别，且只有纸片扩散与临床和流行病学证据一致；应指定纸片扩散为该药物的首选方法。利福平MIC恰好集中在ECOFF之下，界定了可测量的监测目标而非当前的临床问题；若该属开始出现耐药，这可能是最先改变的参数。总之，这些发现支持继续对所有布鲁氏菌菌种使用基于羊种布鲁氏菌的EUCAST 2026折点，并强调地理特异性监测和方法标准化对优化布鲁氏菌病管理的重要性。
