《European Journal of Medicinal Chemistry Reports》：Chemical modification of indirubin reveals a mitochondrial vulnerability and overcomes multidrug resistance in leukemia cells
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新型硫代靛玉红可在白血病细胞中诱导线粒体凋亡。5′-MTI可克服白血病细胞模型中的多药耐药。5′-MTI下调BCL-2且不引起坏死。5′-MTI与阿霉素联用具有协同作用，且不影响健康白细胞。靛玉红是传统中药中的活性成分，具有抗增殖和抗白血病特性。硫代靛玉红作为
新型硫代靛玉红可在白血病细胞中诱导线粒体凋亡。5′-MTI可克服白血病细胞模型中的多药耐药。5′-MTI下调BCL-2且不引起坏死。5′-MTI与阿霉素联用具有协同作用，且不影响健康白细胞。靛玉红是传统中药中的活性成分，具有抗增殖和抗白血病特性。硫代靛玉红作为靛玉红的含硫衍生物，有望成为未来抗白血病化合物开发的模型。研究人员合成了六种新型含硫靛玉红衍生物，并筛选了其对白血病细胞的作用。其中，5′-甲基硫代靛玉红（5′-MTI）被鉴定为诱导凋亡能力最强的化合物。5′-MTI不仅抑制白血病细胞增殖，还诱导细胞凋亡，且对健康人白细胞几乎无凋亡作用。通过LDH释放实验排除了坏死性细胞死亡，Annexin V/PI染色证实5′-MTI主要诱导早期和晚期凋亡，且该凋亡过程部分依赖caspase的激活。5′-MTI能够克服多种耐药白血病细胞模型的多药耐药，包括过表达P-糖蛋白（P-gp）的长春新碱耐药Nalm-6细胞、4-OH-环磷酰胺耐药Nalm-6细胞以及BCL-2过表达的柔红霉素耐药K-562细胞。机制研究表明，5′-MTI诱导活性氧（ROS）生成，降低线粒体膜电位（MMP），下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达，并激活caspase 9。在柔红霉素耐药K-562细胞中，5′-MTI的凋亡诱导作用不依赖BAX和BAK。此外，凋亡PCR芯片分析显示5′-MTI上调肿瘤坏死因子（TNF）超家族多个基因的mRNA表达，提示受体介导的凋亡通路也参与其中。5′-MTI还在离体实验中显示出对复发尤文肉瘤患者肿瘤细胞的作用。研究结果表明，5′-MTI通过线粒体通路诱导凋亡，并能克服多种机制介导的多药耐药，具有潜在的临床转化价值，但需进一步优化其溶解度和进行体内实验验证。
论文解读
一、研究背景与目的
靛玉红是从菘蓝、蓼蓝和木蓝等植物中提取的生物活性化合物，这些植物不仅用作靛蓝染料，也是传统中药的重要成分。靛玉红自1951年首次被研究其抗白血病作用以来，大量研究证实其具有抗增殖和诱导凋亡的特性。靛玉红衍生物通过多种信号通路发挥抗肿瘤作用，包括抑制细胞周期依赖性激酶1和2、Fms样酪氨酸激酶3（FLT3）、信号转导与转录激活因子5（STAT5）信号通路等。然而，靛玉红本身水溶性差，限制了其临床应用。
当前肿瘤治疗面临的一个关键问题是多药耐药（MDR）的出现，尤其是在复发患者中，对常规细胞抑制药物的耐药性显著降低了治愈机会。多药耐药的常见机制之一是P-糖蛋白（P-gp）的过表达，该蛋白属于ATP结合盒（ABC）转运体家族，能主动将药物泵出细胞外，降低细胞内药物积累，从而限制治疗效果。因此，开发能够克服这些耐药机制的新型化合物具有重要意义。
本研究旨在阐明硫代靛玉红衍生物的抗癌作用及其克服多药耐药的能力。研究人员合成了六种新型含硫靛玉红衍生物，并筛选其对白血病细胞的作用，其中5′-甲基硫代靛玉红（5′-MTI）被鉴定为诱导凋亡能力最强的化合物，并对其作用机制进行了深入研究。
二、主要技术方法
研究人员采用多种关键技术方法开展研究：化学合成方法包括重氮盐偶联和多聚磷酸环化反应合成六种硫代靛玉红衍生物；细胞生物学方法包括使用CASY?细胞计数分析仪测定细胞增殖和活力、流式细胞术检测DNA片段化评估凋亡、LDH释放实验排除坏死、Annexin V/PI双染区分早期和晚期凋亡、CellROX? Green染色检测活性氧（ROS）生成、JC-1染色检测线粒体膜电位（MMP）变化；分子生物学方法包括Western blotting检测凋亡相关蛋白表达、RT2 Profiler PCR芯片分析凋亡相关基因mRNA表达变化。细胞系来源包括柏林夏里特医学院提供的Nalm-6、BJAB和K-562细胞系，以及科隆大学医院提供的SK-N-AS神经母细胞瘤细胞系，并建立了多种耐药细胞系。健康人白细胞从研究人员自身血液中分离获得，尤文肉瘤患者肿瘤细胞来自肺转移灶的离体培养。
三、研究结果
3.1 硫代靛玉红在Nalm-6细胞中诱导凋亡
研究人员用六种硫代靛玉红衍生物（化合物1a-1f）处理Nalm-6白血病细胞72小时，通过DNA片段化检测凋亡率。结果显示不同衍生物的凋亡诱导效力存在显著差异：化合物1a、1b和1e未显示显著效果；1c和1f仅在50 μM浓度下诱导凋亡；而化合物1d即5′-MTI在较低浓度范围内即表现出最强的凋亡诱导活性，因此被选为进一步研究的对象。
3.2 5′-MTI在Nalm-6细胞中具有抗增殖作用并选择性诱导白血病细胞凋亡
5′-MTI不仅抑制Nalm-6细胞增殖，还在低浓度下即减少细胞数量，表明其兼具抗增殖和促凋亡作用。在选择性实验中，5′-MTI对健康人白细胞几乎无凋亡诱导作用，而对Nalm-6细胞具有显著凋亡效应，显示出良好的肿瘤细胞选择性。LDH释放实验证实5′-MTI在高达80 μM浓度下不引起坏死。Annexin V/PI染色显示5′-MTI在20 μM低浓度下即诱导早期凋亡，且随浓度升高，早期和晚期凋亡细胞比例增加，活细胞比例相应减少。泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK可部分抑制5′-MTI诱导的凋亡，证实caspase参与该过程。
3.3 5′-MTI克服多药耐药
5′-MTI对4-OH-环磷酰胺耐药Nalm-6细胞（同时对依托泊苷等多种药物交叉耐药）具有显著的凋亡诱导作用。对过表达P-gp的长春新碱耐药Nalm-6细胞，5′-MTI同样有效，且不依赖P-gp抑制。在慢性髓系白血病K-562细胞中，5′-MTI几乎不诱导凋亡，但在柔红霉素耐药K-562细胞（以BCL-2显著过表达和BAX低表达为特征）中显著诱导凋亡。5′-MTI对BCL-2过表达的长春新碱耐药BJAB淋巴瘤细胞也有效，但野生型BJAB细胞对5′-MTI更敏感。在神经母细胞瘤SK-N-AS细胞中，5′-MTI仅在顺铂耐药细胞系中诱导显著凋亡。此外，5′-MTI对复发尤文肉瘤患者肺转移灶来源的肿瘤细胞具有离体杀伤作用。与天然靛玉红相比，5′-MTI的凋亡活性明显更强。
3.4 5′-MTI通过线粒体途径诱导凋亡
JC-1染色显示5′-MTI处理后，Nalm-6细胞中线粒体膜电位降低的细胞比例呈剂量依赖性显著增加。CellROX? Green染色检测到5′-MTI诱导ROS生成增加，而ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可抑制这一效应，证实5′-MTI通过诱导氧化应激影响线粒体功能。
3.5 5′-MTI通过BCL-2信号通路和caspase 9激活诱导凋亡
Western blotting分析显示，5′-MTI处理Nalm-6细胞后，抗凋亡蛋白BCL-2显著下调，同时促凋亡蛋白HRK也显著降低。caspase 9的活化（切割形式）在Nalm-6细胞中仅轻微检测到，但在BJAB细胞中显著增强。此外，5′-MTI在BJAB细胞中轻微但显著下调了凋亡抑制蛋白XIAP。在柔红霉素耐药K-562细胞中，5′-MTI部分下调了过表达的BCL-2，但未诱导BAX和BAK的表达，提示凋亡诱导不依赖BAX/BAK孔的形成。MCL-1蛋白水平在两种K-562细胞系中均略有升高。
3.6 5′-MTI诱导凋亡涉及受体介导通路
凋亡PCR芯片分析显示，5′-MTI处理Nalm-6细胞12小时后，多个TNF超家族基因mRNA表达显著上调，包括淋巴毒素β受体（LTBR，上调42.17倍）、肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9/CD137，上调27.63倍）、淋巴毒素α（LTA，上调15.33倍）、CD40配体（CD40LG，上调15.01倍）、TNFSF8（上调12.03倍）、TP73（上调11.30倍）和BCL2L10（上调10.04倍）。在柔红霉素耐药K-562细胞中，5′-MTI处理后总BID蛋白水平略有降低，提示部分BID可能已被切割激活，但截短型BID（tBID）未能通过Western blotting检测到。
四、讨论与结论
讨论部分指出，硫代靛玉红作为靛玉红的含硫类似物，将吲哚酮或吲哚昔单元中的氮替换为硫。与文献中报道的硫位于吲哚酮单元的硫代靛玉红不同，本研究合成的化合物硫位于吲哚昔单元，且因缺乏N-H位点可能不再具有立体锁定构型。5′-MTI在体外对多种恶性细胞系表现出细胞毒性和增殖抑制作用，且不影响健康白细胞，并能克服白血病细胞的多药耐药。
机制研究表明，5′-MTI的作用机制明确指向内源性线粒体凋亡通路。BCL-2家族蛋白在线粒体调控中发挥关键作用，5′-MTI在BCL-2过表达的耐药细胞中下调BCL-2蛋白水平，直接作用于可能促成细胞耐药的信号通路。由于BCL-2在线粒体通路中的核心作用，其下调不仅是克服多药耐药的潜在靶点，也可能适用于以BCL-2过表达为恶性机制的肿瘤细胞。在BAX几乎不表达的Nalm-6和柔红霉素耐药K-562细胞中仍能检测到凋亡，表明凋亡可独立于BAX发生。5′-MTI诱导ROS生成和MMP改变，与靛玉红及其衍生物的研究结果一致，ROS可导致MMP改变，进而通过诱导细胞色素C外流启动线粒体通路。caspase 9的切割激活进一步支持线粒体凋亡通路的参与。
PCR芯片结果提示受体介导的凋亡通路也可能参与其中，TNF超家族多个成员的mRNA上调支持这一假设。CD137（TNFRSF9）mRNA近30倍的上调值得关注，因为CD137已知在癌细胞表面高表达，T细胞可据此特异性攻击癌细胞，5′-MTI对CD137的上调可能有助于特异性免疫抗体靶向治疗。但mRNA水平的变化不一定反映蛋白水平的变化，因此仅提供指示性证据。
讨论部分也指出了5′-MTI应用的局限性：需要较高浓度才能产生效果，且溶解度较差，在高浓度下可能出现结晶沉淀，限制给药剂量。此外，硫代靛红类化合物在C-C双键处可能发生光异构化，虽然产生的异构体不稳定并在15-20分钟内重新异构化，但实验中需避光操作。
结论部分强调，靛玉红衍生物如5′-MTI对肿瘤细胞的显著效果为癌症治疗开辟了广阔领域，尤其在克服细胞抑制药物耐药方面值得未来深入研究。如果能够改善5′-MTI的溶解度从而可能降低给药剂量，将进一步拓展其治疗可能性。对5′-MTI的进一步开发表明，继续改进已有化合物是值得的，研究重点不应仅放在新治疗药物的开发上。研究初步揭示了硫代靛玉红5′-MTI的作用机制，未来研究应聚焦于结构优化以及作用机制和靶点的更详细研究。
