TNF/TNFR1通过抑制自噬相关信号，促进棕榈酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗

《European Journal of Pharmacology》：TNF/TNFR1 promotes palmitic acid-induced insulin resistance in HepG2 cells by suppressing autophagy-associated signaling

　　摘要背景：细胞内脂质积累与棕榈酸（PA）诱导的胰岛素抵抗（IR）密切相关。本研究旨在阐明肿瘤坏死因子（TNF）/肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）轴在PA诱导的HepG2细胞IR及脂质代谢异常中的作用。方法：将HepG2细胞暴露于PA（0–500 μM）。分别通过乳酸脱氢酶（LDH）释放、葡萄糖测定和油红O染色评估细胞损伤、葡萄糖代谢和脂质积累。通过差异表达和蛋白质-蛋白质相互作用分析从GSE174475数据集中鉴定关键基因。进行TNFR1过表达和TNF沉默以验证功能。通过LC3 II/p62表达、免疫荧光、透射电子显微镜和巴弗洛霉素A1（Baf-A1）处理评估自噬通量。结果：PA（250 μM）损害胰岛素信号，降低AKT磷酸化、质膜葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）/葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）水平、葡萄糖摄取和胰岛素反应性。PA增加TNF表达，并通过SREBP1c及脂肪生成/脂质摄取促进脂质积累。TNF敲低减弱了PA诱导的IR相关改变、脂质沉积和自噬相关改变，而TNFR1过表达逆转了这些效应。基于Baf-A1的通量分析进一步表明，PA损害自噬通量，这被TNF敲低恢复，并被TNFR1过表达逆转。LC3 II和p62的变化进一步表明TNF/TNFR1信号可能促成了这种损害。结论：TNF可能损害自噬通量和脂质代谢，从而通过TNFR1促进PA诱导的脂毒性和IR样表型。这些发现为靶向TNF/TNFR1治疗脂质积累相关IR提供了理论依据。引言代谢综合征（MetS）是一种复杂的疾病，以多种代谢异常为特征，如葡萄糖耐量降低、中心性肥胖、血脂异常和高血压[1]。越来越多的数据表明，MetS的主要病理生理机制是胰岛素抵抗（IR）。流行病学研究表明，全球范围内MetS的发病率在20%到25%之间[2]。IR是心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和2型糖尿病（T2DM）的主要风险因素[3]。由于过量游离脂肪酸（FFAs），特别是棕榈酸（PA）等饱和脂肪酸，在肝细胞中引起脂质堆积和脂毒性，它们在IR的发展中至关重要[4]。通过多种途径，包括抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）途径和下调葡萄糖转运蛋白，肝脏脂质积累损害胰岛素信号。例如，临床证据显示，循环FFAs水平较高的人葡萄糖清除率低得多，这与外周和肝脏IR一致[5]。此外，自噬活性降低与脂质代谢失调密切相关，这加剧了胰岛素信号异常[6]。目前尚不清楚肿瘤坏死因子（TNF）/肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）是否介导PA诱导的脂质积累和IR。肿瘤坏死因子-α（TNFα）是一种主要通过TNFR1作用的促炎细胞因子，由TNF编码，对代谢平衡有重大影响[7]。据报道，T2DM和肥胖患者的循环TNFα水平升高，这与IR的严重程度正相关[8]。在机制上，TNFα通过促进IRS蛋白的丝氨酸磷酸化来破坏胰岛素信号，从而阻止PI3K和AKT的后续激活[9]。虽然肝细胞中慢性TNFα暴露通过激活甾醇调节SREBP1c和FAS导致脂肪堆积，但动物模型实验研究表明，中和TNFα可增强胰岛素敏感性[10]。这一关联得到临床数据的进一步支持；例如，脂肪组织中TNFα表达升高与肝脏脂肪变性和葡萄糖吸收减少有关[11]。除了脂质代谢，TNFα还调节自噬，这对于维持细胞能量平衡是必要的。研究表明，失调的TNFα信号通过增加p62和减少LC3 II产生来抑制自噬流，从而加剧脂质积累和IR[12]。尽管有这些发现，TNFα在肝细胞中促成PA诱导的脂质堆积、自噬抑制和IR的确切分子途径仍不完全清楚。基于这些观察，我们试图阐明TNF及其受体TNFR1在介导PA诱导的肝细胞代谢紊乱中的作用。我们使用PA诱导的HepG2细胞来创建体外模型，评估TNF/TNFR1信号在控制脂质沉积、自噬和IR相关特征中的功能。然后，我们检查了TNFR1是否作为TNF的关键下游效应器。此外，阐明TNF/TNFR1介导的自噬和脂肪生成调节可能为代谢综合征和NAFLD提供新的治疗靶点，其中脂质过载和胰岛素信号缺陷导致系统性代谢功能障碍。章节片段差异表达基因（DEGs）的生物信息学分析从基因表达综合数据库（GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）获得GSE174475数据集，该数据集包括43个个体的皮下脂肪细胞样本。基于胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR），第一四分位数的样本定义为胰岛素敏感（IS，n=16），第四四分位数的定义为胰岛素抵抗（IR，n=27）。使用R软件中的“Limma”包（版本3.48.3）进行差异表达分析。倍数变化在HepG2细胞中建立PA诱导的IR模型将HepG2细胞暴露于递增浓度的PA（0–500 μM）24小时，以建立体外脂毒性模型。这些浓度下PA的毒性效应已在先前研究中广泛记录[13]。为了验证我们实验系统中的细胞毒性特征并确定后续机制研究的最佳浓度，我们进行了LDH释放测定。LDH释放呈剂量依赖性增加，其中250 μM PA显示中度细胞毒性讨论通过脂质堆积、自噬受损和胰岛素信号失调的结合，我们在这项研究中证明了PA在HepG2细胞中诱导IR相关改变。在机制上，PA处理抑制了葡萄糖转运蛋白GLUT2和GLUT4的表达，并显著降低了AKT磷酸化，从而阻碍了葡萄糖摄取。同时，PA给药增加了SREBP1c蛋白的表达，并上调了参与脂质摄取和结论我们的研究得出结论，TNF在PA诱导的HepG2细胞IR相关改变和脂质积累中起重要作用。这种效应可能至少部分通过TNFR1介导，这可能有助于自噬通量受损、质膜GLUT2/GLUT4水平降低和AKT磷酸化减少。TNF敲低减弱了这些改变，部分恢复了胰岛素信号和葡萄糖摄取，并减少了脂质积累，可能是通过临床试验不适用。CRediT作者贡献声明Mengting Hu：正式分析，数据管理。Chen Peng：写作–初稿，正式分析，数据管理。Mei Liu：写作–审阅与编辑。Fei Pan：写作–审阅与编辑。Yun Zhang：写作–初稿，正式分析，数据管理伦理批准与参与同意不适用出版同意不适用。数据与材料可用性当前研究中使用和/或分析的数据集可应合理要求从通讯作者处获得。利益冲突作者声明无利益冲突。资金本研究由上海闵行区中心医院院级优秀项目（2026MHPY04）、上海闵行区医学专科建设项目（2025MWFC02）和闵行区区域医疗中心临床专科能力提升项目（CZ202614017）资助利益冲突声明作者声明无利益冲突。致谢无。Yun Zhang|Chen Peng|Mengting Hu|Fei Pan|Mei Liu