单细胞分辨率映射揭示膝骨关节炎软骨下骨间充质干细胞中细胞死亡相关应激程序与成骨-成软骨分化失衡

《Experimental Cell Research》：Single-Cell Resolution Mapping Reveals Cell Death-Associated Stress Programs and Osteogenic-Chondrogenic Differentiation Imbalance in Subchondral Bone Mesenchymal Stem Cells of Knee Osteoarthritis

　　scRNA-seq从四个配对OA软骨下骨文库中保留了25,885个细胞标志物支持图谱解析了外侧和内侧区域的12种细胞状态配对伪体分析鉴定COL1A1为内侧富集的主要信号体分析鉴定出1,805个OA相关基因和六个共表达模块qRT-PCR揭示铁死亡易感OA软骨细胞和铁死亡耐药骨肉瘤细胞引言膝骨关节炎（KOA）影响全球超过2.5亿人，在老龄化人群中位列致残主要原因之一[1], [2]。KOA以进行性关节软骨退变、骨赘形成、软骨下骨重塑和滑膜炎症为特征，引起疼痛、僵硬和功能障碍[3]。尽管对症治疗取得进展，但尚无疾病修饰疗法能阻止OA进展，凸显了对更深层机制理解的必要性[4]。软骨下骨通过与关节软骨的双向串扰在OA发病中发挥关键作用[5], [6]。在OA中，软骨下骨发生硬化，以骨体积增加和异常骨形成为特征，这些改变常先于软骨退变，并可能作为疾病的原始驱动因素[7], [8]。位于该区域的间充质干细胞（MSCs）通过成骨与成软骨分化的平衡协调组织稳态，该平衡受内在转录网络和微环境线索（包括力学负荷、氧张力和炎症信号）的调控[9], [10], [11]。这一平衡的破坏——以OA MSCs中成骨增强和成软骨抑制为标志——可能构成软骨下硬化与软骨退变共存悖论的基础，但调控该谱系命运转换的分子机制仍未被完全阐明[12], [13], [14]。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已深刻改变了我们对肌肉骨骼组织细胞异质性的认识，能够以前所未有的分辨率对单个细胞进行转录组分析[15], [16]。在OA中，scRNA-seq可解析软骨下骨群体的分子多样性，描绘分化轨迹，并鉴定驱动疾病的失调通路[17]。加权基因共表达网络分析（WGCNA）通过鉴定与特定细胞状态或疾病状况相关的共表达基因模块，补充了这一方法，从而能够发现调控谱系承诺的中心调控网络[18], [19], [20]。代谢重编程和细胞应激反应深刻影响MSC分化命运。成骨分化有利于氧化磷酸化和线粒体生物发生，而成软骨分化依赖适合缺氧软骨微环境的糖酵解代谢[21], [22]。在OA中，广泛代谢功能障碍和升高的氧化应激可诱导MSC衰老、损害分化潜力并促进促炎分泌表型[23], [24], [25], [26]。这些应激-代谢扰动代表了OA发病机制中被低估的一个维度，可能从根本上改变MSC谱系决定。铁死亡是一种铁依赖的调节性细胞死亡机制，由致死性脂质过氧化物积累和GPX4耗竭驱动，已成为OA和骨恶性肿瘤中的病理机制[27], [28]。在骨肉瘤中，诱导铁死亡为克服化疗耐药提供了策略，而在OA中，铁过载和氧化应激促进软骨细胞铁死亡和软骨降解[29], [30]。我们模块M6（LOX、NAMPT、BNIP3L）和M8（PRDX5、TP53I13、DKK3）中的缺氧和应激相关基因特征与铁死亡程序部分重叠，提示铁死亡通路可能参与OA软骨下骨MSC功能障碍，并揭示退行性和恶性骨病之间的共同脆弱性。软骨下骨微环境通过涉及免疫细胞、内皮细胞和分化骨细胞的细胞间通讯网络进一步调节MSC分化[31], [32]。在OA中，细胞组成改变和慢性炎症使这些旁分泌和接触介导的相互作用失调，促进病理MSC行为[33]。目前的细胞疗法，包括MSC移植，结果不一致，部分原因是对内源性MSC功能障碍认识不足[34], [35], [36]。鉴定恢复MSC分化平衡的分子靶点仍是疾病修饰性OA治疗的优先事项。在本研究中，我们应用scRNA-seq结合WGCNA全面表征KOA中软骨下骨MSCs的分子图谱。我们的目标是定义细胞异质性、鉴定不同的MSC亚群和分化状态、表征调控成骨和成软骨谱系的基因模块、重建分化轨迹，以及绘制调控MSC命运的细胞-细胞相互作用网络。通过这一整合分析，我们为OA发病机制提供了新的机制见解，并鉴定了恢复分化平衡和促进关节保护的可能治疗靶点。章节片段研究设计与公共数据集本再分析使用了公共人类胫骨平台软骨下骨数据集GSE196678（单细胞RNA测序）和GSE51588（体表达微阵列）。单细胞数据集是OA中供体内侧与外侧的比较，而非健康与OA数据集。体数据集既作为供体水平OA与正常比较分析，也作为OA组和正常组内的配对内侧减外侧对比分析。输入文件及其SHA-256校验和为质量控制与整合单细胞图谱经预设过滤后，保留了31,090个输入细胞中的25,885个（图1A）。检测基因分布四个文库间相当（图1B）。整合图谱由文库着色、批感知UMAP表示（图1C），外侧和内侧密度轮廓分别覆盖12,504和13,381个细胞（图1D）。累积检测基因分布支持携带3,000个高变基因进行图谱构建（图1E）。文库水平中位数讨论这项全面的单细胞转录组分析揭示了膝骨关节炎进展过程中软骨下骨间充质干细胞成骨-成软骨分化失衡的潜在基本机制。通过整合包括WGCNA、轨迹推断和空间分析在内的高级计算手段[37]，我们在软骨细胞谱系中鉴定出八个不同的分子模块，这些模块代表了OA中失调的连贯功能程序。结论这项整合单细胞转录组分析全面表征了膝骨关节炎进展过程中软骨下骨间充质干细胞成骨-成软骨分化失衡的分子机制。我们鉴定出八个不同的软骨细胞分子模块，具有不同功能，包括免疫调节（M1）、成熟软骨形成（M2）、ECM重塑（M3）、氧化代谢（M4）、糖酵解（M5）、缺氧应激（M6）、核糖体CRediT作者贡献声明Zilong Ye：写作—审阅与编辑、写作—初稿、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法学。Fangyi Dai：软件、资源、方法学、概念化。Ming Zhu：写作—初稿、验证、软件、调查、正式分析、数据管理、概念化。Zhong Zhou：写作—审阅与编辑、写作—初稿、软件、方法学、概念化出版同意不适用。参与同意不适用。数据可用性本研究使用的所有源数据均可公开获取于Gene Expression Omnibus，登录号为GSE196678和GSE51588。伦理声明本研究利用公开可用的去标识化单细胞RNA测序数据集，未直接采集人类标本。所有原始数据生成均遵循机构审查委员会批准和知情同意程序，详见原始出版物。利益冲突作者声明无利益冲突。临床试验声明本研究非临床试验。数据可用性所有源数据均公开于GEO，登录号为GSE196678和GSE51588。可复现分析脚本、持久化处理后的单细胞对象、体结果对象、包括输入校验和在内的元数据、图形生成脚本以及本结果关联手稿源文件均随提交包提供。单细胞条形码至文库映射及其配对区域解释记录于Data/analysis_metadata.json。资助无。利益冲突声明所有作者声明其与其他人员或组织之间不存在可能不当影响或偏倚其工作的财务和个人关系。作者声明无利益冲突。Zilong Ye|Ming Zhu|Fangyi Dai|Zhong Zhou