发酵乳清蛋白摄入后的人血清促进C2C12肌管生长与蛋白合成：一项随机、双盲、主动对照交叉试验

《Experimental Gerontology》：Human serum collected after fermented whey protein supplementation stimulates myocellular growth and protein synthesis: A randomized, double-blind, active-controlled crossover trial

　　

发酵乳清蛋白补充后采集的人血清刺激肌细胞生长与蛋白合成：一项随机、双盲、主动对照交叉试验。年龄相关合成抵抗（anabolic resistance）促进骨骼肌丢失。将发酵乳清蛋白（fermented whey protein）与常规乳清蛋白（conventional whey protein）进行比较。将年轻和老年男性的餐后血清（postprandial serum）处理C2C12肌管（C2C12 myotubes）。发酵乳清蛋白增加蛋白合成（protein synthesis）和肌管肥大（myotube hypertrophy）。

研究背景：年龄相关骨骼肌质量与功能下降可导致身体衰弱、代谢功能障碍和生活质量下降，称为肌肉减少症（sarcopenia）。合成抵抗（anabolic resistance）指骨骼肌对膳食蛋白等合成刺激的反应减弱，被认为是增龄性肌肉丢失的原因之一；但健康、无心血管或代谢疾病的老年人对营养或运动刺激的反应仍可与年轻人相当，提示合成抵抗并非普遍存在，而取决于健康状态、体力活动以及刺激的性质和强度。骨骼肌质量由肌肉蛋白合成（MPS，muscle protein synthesis）与降解的平衡决定；抗阻运动和膳食蛋白可通过机制性雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1，mechanistic target of rapamycin complex 1）通路促进MPS。乳清蛋白因消化快、必需氨基酸（EAA，essential amino acids）尤其亮氨酸含量高，可增加循环氨基酸并刺激mTORC1依赖性MPS；但老年人的合成反应常减弱。发酵乳清蛋白因发酵可改变肽谱并产生生物活性化合物而受到关注；已有研究提示其与抗阻训练结合可增加中年男性握力和大腿围，并可抑制培养肌细胞萎缩，但其对衰老骨骼肌合成与代谢反应仍不清楚。既往研究多依赖人体干预结局或直接以氨基酸/肽处理细胞，不能完全反映摄入后的消化、吸收和内分泌信号整合；以人或鼠血清处理肌细胞可纳入系统因素，但少有研究比较不同膳食蛋白及年龄差异。因此，研究人员开展随机交叉试验，比较常规乳清蛋白与发酵乳清蛋白摄入后血清对年轻和老年男性C2C12肌管直径、蛋白合成与降解信号及线粒体标志的影响，并假设发酵乳清蛋白血清引起更大合成和线粒体相关反应且年龄间存在差异。

研究人员纳入12名健康年轻男性（21.8±0.9岁）和12名健康老年男性（72.8±4.4岁），采用随机、双盲、主动对照交叉设计，间隔1周洗脱，摄入Fermentis或对照乳清后采集餐后血清处理C2C12肌管。结论提示，Fermentis摄入后血清尤其老年供者血清较常规乳清更有效激活mTORC1下游，促进MPS和肌管肥大，并影响ACC/p38氧化代谢信号，且似乎独立于血浆亮氨酸/EAA升高；其意义在于为发酵乳清蛋白在衰老骨骼肌合成与氧化代谢中的潜在作用提供细胞水平证据，但不能直接推断人体骨骼肌反应。

关键技术方法（不超过250字）：采用随机、双盲、主动对照交叉设计，样本来自12名健康年轻男性和12名健康老年男性（Ritsumeikan University伦理批准，UMIN000059219注册）；受试者摄入Fermentis或对照乳清，于45、60、75、90 min采血，用自我血糖监测（SMBG，self-monitoring of blood glucose）测血糖，氨基酸分析仪测血浆亮氨酸和EAA；以10%人血清处理C2C12肌管，免疫染色测肌管直径，表面感应翻译（SUnSET，surface sensing of translation）测MPS，Western blot测mTORC1上游/下游、蛋白水解、自噬、氧化代谢和线粒体标志，BCA测总蛋白。

研究结果：3.1 身体成分（Body composition）：通过人体测量和生物电阻抗分析，老年男性去脂体重显著低于年轻男性，脂肪量和体脂率显著高于年轻男性；体重和体质指数无显著差异。3.2 血液分析（Blood analysis）：通过SMBG和氨基酸分析，老年男性血糖浓度及增量曲线下面积（AUCi，incremental area under the curve）高于年轻男性；乳清类型不影响90 min内血糖。血浆亮氨酸和EAA随时间及年龄变化，老年男性AUCi更高；对照乳清条件下老年男性EAA AUCi显著高于年轻男性，而Fermentis条件下该年龄差异不存在；老年男性Fermentis与对照乳清EAA AUCi无显著差异。3.3 总蛋白浓度和肌管直径（Total protein concentration and myotube diameter）：通过BCA和免疫染色，Fermentis血清处理细胞总蛋白浓度高于对照；24 h血清处理后肌管直径在Fermentis大于对照、老年血清大于年轻血清，无蛋白×年龄交互。3.4 mTORC1相关信号和MPS（Markers of mTORC1-associated signaling and MPS）：通过Western blot和puromycin标记，Fermentis及老年血清降低Akt Thr³⁰⁸和Ser⁴⁷³磷酸化，年轻Fermentis较对照降低；老年血清降低结节性硬化复合物2（TSC2，tuberous sclerosis complex 2）Thr¹⁴⁶²磷酸化和REDD1（regulated in development and DNA damage responses 1）；Fermentis不影响TSC2、REDD1、p-mTOR和PRAS40。Fermentis和老年血清增加核糖体S6激酶1（S6K1，ribosomal S6 kinase 1）Thr³⁸⁹；Fermentis不影响核糖体蛋白S6（rpS6，ribosomal protein S6）Ser^240/244和真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1，eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1）Thr^37/46，但降低真核翻译延长因子2（eEF2，eukaryotic translation elongation factor 2）Thr⁵⁶。MPS有年龄主效应和交互，老年Fermentis血清较年轻Fermentis显著增加MPS，老年内Fermentis较对照有增加趋势。3.5 蛋白水解信号（Markers of proteolytic signaling）：通过Western blot，老年血清降低叉头框O3a（FoxO3a，forkhead box O3a）Ser²⁵³磷酸化、总FoxO3a和Fbx32；Fermentis不影响FoxO3a、Fbx32、肌肉特异性RING指蛋白1（MuRF1，muscle-specific RING finger 1）及泛素化蛋白。老年血清增加UNC-51样激酶1（ULK1，UNC-51 like kinase 1）Ser⁷⁵⁷，降低微管相关蛋白1轻链3β（LC3B，microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta）-II、LC3B-II/I和p62；Fermentis不影响自噬指标。3.6 氧化代谢和线粒体标志（Markers of oxidative metabolism and mitochondria）：通过Western blot，Fermentis+老年血清降低5′-腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK，5′-adenosine monophosphate-activated protein kinase）Thr¹⁷² vs年轻；Fermentis和衰老增加乙酰辅酶A羧化酶（ACC，acetyl-CoA carboxylase）Ser⁷⁹；Fermentis增加p38 Thr¹⁸⁰/Tyr¹⁸²；过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α，peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha）仅见老年血清主效应。柠檬酸合成酶有蛋白×年龄交互，非发酵条件下老年血清低于年轻；老年血清降低电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC1，voltage-dependent anion-selective channel 1）；Fermentis不影响；细胞色素c和呼吸链复合体蛋白无显著影响。

讨论部分总结：Uemichi等指出，研究首次显示Fermentis摄入后血清尤其老年供者血清促进肌管MPS、肥大和氧化代谢相关反应，且不依赖体内循环氨基酸浓度。两种乳清间血浆亮氨酸/EAA无差异；EAA AUCi在对照乳清下老年高于年轻，Fermentis下差异消失；因首样在45 min，可能错过早期峰值，不能解释为整体消化吸收降低。24 h血清使肌管直径增加，老年血清大于年轻，与体内年龄性萎缩相反，提示蛋白摄入可能减轻年龄相关血清促生长特性下降。Akt在年轻Fermentis降低、老年无论蛋白均低；S6K1在Fermentis和老年血清增加；老年Fermentis血清MPS增加；eEF2降低提示翻译延长参与。蛋白水解指标无Fermentis额外效应，提示生长效应主要来自合成信号而非抑制降解。老年血清降低柠檬酸合成酶/VDAC1，Fermentis增强ACC/p38而未增AMPK/PGC-1α，提示可能独立于AMPK/PGC-1α。局限性包括：血清模型不能直接推断人体骨骼肌；MPS和信号仅4 h单时间点；线粒体含量24 h未评估。

研究结论翻译：单次摄入发酵乳清蛋白后的人血清较常规乳清蛋白更有效激活C2C12肌细胞mTORC1下游靶点，且与供者年龄无关，尤其在老年供者血清条件下促进MPS反应和肌管肥大；这些效应似乎独立于血浆亮氨酸或EAA升高；Fermentis血清不仅驱动肌肉细胞合成反应，还通过ACC和p38信号调节氧化代谢；研究结果有助于理解发酵相关餐后循环因子变化如何影响衰老骨骼肌合成和氧化代谢反应。