人类急性髓系白血病模型中KMT2A融合的比较分析：PROM1生物标志物与多巴胺受体拮抗剂的选择性靶向

《Experimental Hematology》：Comparative analysis of KMT2A fusions in human models of acute myeloid leukemia

　　

PROM1作为一种癌症干细胞标志物，在人类KMT2A-MLLT4急性髓系白血病（AML）模型中被观察到。多种多巴胺受体拮抗剂（dopamine receptor antagonists, DRAs）可选择性地抑制KMT2A-MLLT4 AML。计算机模拟与核磁共振（NMR）研究支持DRAs与S100A8/A9异源二聚体结合。

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种遗传异质性癌症，以骨髓中原始白血病母细胞过度生长为特征。KMT2A（赖氨酸甲基转移酶2A基因）融合在儿童AML中尤为常见，其中KMT2A-MLLT4融合（KM4）约占儿童AML的10%以下，但患者5年无事件生存率（11%）和总生存率（22%）极低，属于预后不良亚型。其融合蛋白MLLT4具有独特的胞质定位、PDZ结构域和两个RAS相关（RA）结构域，且致癌性依赖蛋白二聚化和DOT1L（组蛋白甲基转移酶）活性；相比之下，更常见的KMT2A-MLLT3融合（KM3）主要招募超延伸复合体（SEC）激活转录。两者分子机制和临床结局显著不同，但在患者转录组水平上难以区分，既往也缺乏系统性比较。近年来，利用人脐带血细胞构建的工程化白血病模型为大规模药物筛选和机制研究提供了新平台。为此，研究人员系统比较了KM4-AML和KM3-AML人类模型，以期发现亚型特异的分子特征和治疗靶点。

主要技术方法：
研究人员从脐带血CD34⁺细胞构建了KMT2A-MLLT4和KMT2A-MLLT3融合的人类白血病模型（参考既往方法），并结合患者样本队列（TARGET儿科AML队列108例：86例KM3、22例KM4；BEAT AML队列；1608例AML生存数据；以及研究人员自建的患者来源异种移植（PDX）样本）进行验证。主要技术包括：RNA测序（RNA-seq）分析转录组差异；ATAC-seq（转座酶可及染色质测序）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析表观遗传特征；高通量小分子药物筛选（11,142种化合物）鉴定选择性抑制KM4-AML的药物；分子对接（FlexAID/NRGsuite）预测化合物与候选靶蛋白的结合；核磁共振（NMR）¹H-¹⁵N HSQC（异核单量子相干谱）和T2弛豫实验验证结合。

研究结果：

1. KM4-AML和KM3-AML的转录组高度相似（The transcriptomes of KM4-AML and KM3-AML are highly similar）
对TARGET数据集中108例患者样本（86例KM3-AML、22例KM4-AML）的RNA-seq数据进行主成分分析（PCA），发现两组患者转录组在二维空间中基本无法区分，但KM4患者的生存曲线略差。随后研究人员对15例KM4模型和相应KM3模型进行层次聚类，发现大多数KM4模型与2/3的KM4患者样本聚在一起，且KM4模型与KM3模型形成两个不同分支，表明两种融合基因各自引起细微但可分辨的转录组改变。

2. 基因表达谱将PROM1鉴定为KM4-AML的潜在生物标志物（Gene expression profiles identifies PROM1 as a potential biomarker for KM4-AML）
通过比较KM3-AML和KM4-AML模型的白血病转录组，研究人员鉴定出445个基因在KM4中显著上调，功能富集分析显示这些基因涉及RNA聚合酶II转录调控和细胞周期等过程。其中上调最显著的基因是PROM1（prominin-1/CD133，五跨膜糖蛋白，造血干/祖细胞标志物）。在TARGET KMT2A重排患者队列中，KMT2A-MLLT3患者PROM1表达几乎缺失，而KMT2A-MLLT10等高危亚型显著富集；BEAT AML队列中PROM1高表达也与ELN2017不良风险组和较差生存显著相关。

3. KM3与KM4 AML之间的表观遗传差异（Epigenetic differences between KM3 and KM4 AML）
研究人员利用ATAC-seq和ChIP-seq分析了H3K4me3和H3K27me2修饰在基因组上的分布。结果显示KM3和KM4模型之间的差异峰很少，与转录组相似性一致。但在PROM1/TAPT1基因座，表观遗传信号与基因表达水平相关，提示PROM1表达可能受类似KMT2A-MLLT2介导的染色质环机制调控。此外，在6个AML细胞系中过表达PROM1后进行RNA-seq，发现几乎无基因表达变化，表明PROM1单独过表达不足以改变AML细胞转录组。

4. 高通量药物筛选揭示多巴胺受体拮抗剂是潜在的KM4-AML治疗药物（A high-throughput drug screen reveals dopamine receptor antagonist as potential KM4-AML therapeutics）
在包含11,142种化合物的高通量筛选中，研究人员发现840个化合物能抑制白血病生长但不影响正常脐带血CD34⁺细胞，其中58个化合物对KM4-AML有选择性。这些化合物中包括多种FDA批准的多巴胺受体拮抗剂（dopamine receptor antagonists, DRAs），尽管KM4细胞本身几乎不表达多巴胺受体。剂量反应分析显示，GBR 12935二盐酸盐（vanoxerin）等DRA对KM4-AML模型的IC₅₀低于KM3-AML和正常细胞；10 μM浓度下，硫利达嗪（thioridazine, TDZ）对KM4-AML细胞系达到近100%生长抑制，而对KM3-AML细胞系抑制较低。

5. 多巴胺受体拮抗剂的对接模拟（Docking simulations of dopamine receptor antagonists）
为了探索DRA的潜在靶点，研究人员对21种DRA与ANXA6、S100A8、S100A9以及S100A8/S100A9异源二聚体进行了分子对接模拟。结果显示大多数DRA优先对接于ANXA6的最大口袋，且S100A8/S100A9异源二聚体给出较高的互补性评分。NMR实验中，三氟拉嗪（trifluoperazine, TFP）和硫利达嗪显著扰动¹⁵N标记的S100A8/S100A9异源二聚体的¹H-¹⁵N HSQC谱峰，而多奈哌齐和奥芬那君仅引起微小扰动；T2弛豫实验也显示TFP和硫利达嗪与蛋白的结合能力明显更强。

讨论与结论：
讨论部分指出，虽然KM4和KM3临床风险分层不同，但患者转录组PCA无法区分，说明融合基因以外的遗传异常（如KRAS/NRAS突变）可能同样影响疾病行为和结局。PROM1虽然与癌症干细胞表型和白血病干细胞（LSC）基因表达特征相关，但过表达实验未观察到转录改变，因此其更可能作为干细胞样状态的标志物而非功能性驱动因素。DRA类药物在KM4细胞中的选择性可能涉及脱靶效应，特别是钙稳态相关通路；分子对接和NMR支持部分DRA可与S100A8/S100A9结合，但实验所用浓度远高于生理水平，其确切机制仍需更多研究。由于DRA中的硫利达嗪此前已有临床试验显示出一定的原始细胞清除效果，而本研究中其他DRA（如GBR 12935）具有更强的效力，这为药物重定位提供了新的候选方向。

研究结论可翻译为：总之，该研究强调了KM4与KM3 AML的独特分子特征，并鉴定出多种对KM4-AML模型具有优先活性的多巴胺受体拮抗剂。这项工作为未来针对侵袭性儿童AML亚型的靶向治疗（包括药物协同研究）提供了更充分的理论依据。鉴于儿童AML患者中观察到的遗传异质性，在治疗KMT2A介导的白血病时，需要采用考虑患者特异性遗传差异的个体化方法，以改善患者的生存结局。