发育线索与阶段匹配微环境助力工程化可植入人源造血干细胞

《Experimental Hematology》：Developmental Cues and Stage?Matched Niches for Engineering Engraftable Human HSCs

　　

在实验室中生成功能完全成熟的人类造血干细胞（haemopoietic stem cells，HSCs）数十年来一直是再生医学的主要目标。这些细胞可用于血液疾病的个性化治疗，并为研究人类血液系统的形成、成熟及疾病中的失调提供强大模型。人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs），包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，hESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，hiPSCs），因可被引导形成几乎任何细胞类型并模拟人类发育的最早期阶段（这些阶段无法在活体胚胎中直接观察），而尤其具有应用前景。 然而，实现这一目标依赖于对HSCs在人类胚胎中起源机制的深入理解。发育过程中，血液以波浪式方式产生。最早的血细胞形成于卵黄囊，但维持成体血液系统的具有长期自我更新能力的HSCs首先出现于胚胎体内的主动脉-性腺-中肾区（aorta–gonad–mesonephros，AGM），对应卡内基分期14/15期（Carnegie Stage 14/15，CS14/15）胚胎。在该区域，一类特化的内皮细胞经历称为内皮-造血转化（endothelial?to?haematopoietic transition，EHT）的显著过程，产生作为HSCs最早前体的成血细胞。这些前体可通过特定的细胞表面标志物组合和转录特征加以识别。它们依次经由胎盘、胎肝和胎骨髓迁移，在此过程中逐步成熟。近年来的单细胞谱系示踪和转录组学技术使研究人员能够以更高精度绘制这一旅程图谱，揭示体内HSC成熟的关键分子步骤。 与此同时，基于hPSCs的限定分化系统为体外重现早期人类血液发育提供了可控途径。过去三十年间，多个实验室的工作已汇聚成一条从hPSCs产生类pre-HSC群体的分阶段路线图。然而，重要问题仍然存在：这些hPSC来源的pre-HSCs在多大程度上类似于人AGM中的对应细胞？其分子和功能特性在何处一致、何处分岔？这些早期前体与胎肝和骨髓中完全成熟的HSCs有何差异？最终，这些见解能否引导研究人员生成可用于移植的HSCs或推进基于HSC的基因治疗？ 本观点文章基于2025年国际实验血液学学会（International Society for Experimental Hematology，ISEH）网络研讨会中Mikkola教授和Ng副教授团队的研究成果。文章主张，将体内发育研究与工程化hPSC分化系统深度整合将加速对人类HSC形成的理解。通过将这两种互补方法纳入统一框架，研究人员突出了塑造HSC特化和成熟的基本原则，识别了两个系统之间的趋同与分岔点，并概述了必须解决的关键挑战。最终，这一整合视角旨在引导该领域走向在体外生成功能完全成熟的HSCs，并推进下一代基于HSC的疗法。

论文解读文章

一、研究背景与问题

在实验室中生成功能完全成熟的人类造血干细胞（HSCs）是再生医学数十年来追求的核心目标之一。HSCs可用于血液疾病的个性化细胞治疗，也可作为研究人类血液系统形成、成熟及疾病中失调过程的强大模型。人类多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（hiPSCs），因具有分化为几乎任何细胞类型的潜能，并能模拟无法在活体胚胎中直接观察的人类发育最早期阶段，而被视为实现这一目标的最有前景的细胞来源。

然而，实现这一目标面临多重障碍。首先，人类HSCs在胚胎中的起源机制尚未完全阐明。发育过程中，血液以波浪式方式产生：最早的血细胞形成于卵黄囊，但具有长期自我更新能力、可维持成体血液系统的HSCs首先出现于胚胎体内的主动脉-性腺-中肾区（AGM），对应卡内基分期14/15期（CS14/15）胚胎。在该区域，特化的血管内皮细胞经历内皮-造血转化（EHT），产生HSCs的最早前体。这些前体随后依次经由胎盘、胎肝和胎骨髓迁移，在此过程中逐步获得成熟功能。其次，尽管基于hPSCs的体外分化系统在过去三十年间取得了长足进展，已能产生具有pre-HSC特征的细胞群体，但这些细胞大多缺乏稳定的长期移植重建能力。关键问题在于：hPSC来源的pre-HSCs在多大程度上类似于人AGM中的天然对应细胞？其分子和功能特性在何处趋同、何处分岔？为何转录特征上已接近HSC的细胞仍无法有效植入？这些问题促使研究人员将体内发育研究与体外工程化分化系统进行深度整合，以揭示HSC特化和成熟的核心原理。

二、研究内容与主要结论

本文基于2025年国际实验血液学学会（ISEH）网络研讨会中Mikkola教授和Ng副教授团队的研究成果，系统整合了体内发育研究与hPSC分化系统的互补优势。研究得出以下核心结论：发育生物学与hPSC系统在HSC特化路径上高度趋同，均以HOXA?胚胎内中胚层为起点，经由主动脉内皮起源、生血内皮（HE）形成和EHT过程，最终获得AGM样HSC表型；然而，两者在HSC功能成熟方面存在显著分岔，hPSC来源的iHSCs在转录层面已具备HSC特征，但在表观遗传状态、代谢成熟度和移植能力上仍与天然胎肝HSCs存在差距。研究明确指出，HSC特化与功能成熟可以被解偶联，而EHT后的成熟过程是当前体外生成功能性HSCs的主要瓶颈。

三、关键技术与方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是单细胞RNA测序（scRNA?seq），对人AGM（CS14-CS15b期）和胎肝组织进行转录组图谱绘制，定义了通用人类HSC特征签名；二是多组学分析，整合转录组与染色质可及性数据，揭示HSC相关群体共享的表观遗传连续体；三是基于hPSCs的定向分化平台，采用悬浮胚状体系统，通过WNT激活、视黄酸信号调控和VEGF撤除等策略，引导iPSCs依次经历中胚层诱导、HOXA模式化、内皮形成和EHT；四是基因编辑报告细胞系，包括HLF-TdTomato、ALDH1A1报告系及SOX17-mCherry和RUNX1C-GFP报告系，用于实时追踪HSC样细胞的出现；五是免疫缺陷小鼠移植实验，评估iHSCs的多谱系长期植入能力。样本来源包括人CS14/15期胚胎AGM组织、人胎肝组织、脐带血和动员外周血。

四、研究结果

体内人类HSC发育图谱的绘制。 Mikkola团队通过对人AGM（CS14-CS15b期）进行scRNA?seq分析，定义了区分HSCs（CD34? CD90? RUNX1? HOXA9? MLLT3? MECOM? HLF? SPINK2?）与非HSC群体的通用人类HSC特征签名。该分析还揭示了HOXA基因在人类HSCs和内皮亚群（血管、动脉和生血内皮）中独特的共享表达模式，该模式在非HSC群体中完全缺失。进一步分析定义了从pre-内皮（CXCR3? IL33? ALDH1A1?）到内皮（CXCR4? KCNK17? ALDH1A1?）再到真正HSCs（SPINK2? KCNK17? ALDH1A1?）的EHT过程中连续进展的标志物。多组学分析表明这些群体共享表观遗传连续体，RUNX1调控位点在多种状态下均处于可及状态。对人胎肝的scRNA?seq分析进一步阐明了发育中造血细胞的谱系输出演变：4-5周时淋巴-髓系祖细胞（LMP）占主导，6周时转录组定义的HSCs首次出现，8周时HSCs已能活跃产生淋巴、髓系和红系细胞。

GPI-80与MLLT3的功能发现。 研究人员鉴定出GPI-80（一种糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白）作为人类HSC出现后表达的新型标志物，可用于识别胎肝和骨髓中具有自我更新能力的HSCs。通过整合三个独立基因表达数据集，研究人员发现MLLT3（超级延伸复合体成员，可与DOT1L相互作用）是体外维持功能性HSCs的关键缺失因子。在脐带血HSCs中过表达MLLT3可实现12倍的HSC扩增，且扩增后的细胞保持可植入性且未发生白血病转化。

MYCT1的调控作用。 研究人员鉴定出MYCT1（myc靶基因1）作为此前未被认识的人类HSC生物学调控因子。MYCT1通过调节内吞作用维持细胞外配体可用性，协调微环境依赖的信号传导。MYCT1缺失导致过度活跃的内吞和过度信号传导，引发细胞应激和HSC成熟受损。MYCT1在培养的HSCs中表达迅速下降，提示其可作为HSC功能性的标志物。

体外iHSC分化系统的建立。 Ng/Stanley/Elefanty团队建立了基于悬浮胚状体的hPSC分化平台。通过激活素拮抗剂（SB 431542）和WNT激动剂（CHIR 99021）的组合实现HOXA诱导，配合视黄酸处理和VEGF撤除，引导iPSCs经过中胚层诱导、HOXA模式化、动脉特化和EHT，产生CD34?造血细胞。移植实验证实这些iHSCs在小鼠体内实现多谱系植入，产生红系、髓系和淋巴系细胞，并表达HSC特征基因（MECOM、MLLT3、HLF、HOXA9、RUNX1、SPINK2）。ALDH1A1报告系分析显示，稀有的ALDH1A1? iHSCs具有强大的多谱系骨髓和脾脏植入潜能，富集CD90?和CD201?细胞。

趋同与分岔的整合分析。 发育研究与hPSC系统在HSC特化核心路径上高度趋同：均经由HOXA?胚胎内中胚层、主动脉内皮起源、HE和EHT过程。然而，在功能成熟层面存在显著分岔：iHSCs虽获得HSC相关转录特征，但其表观遗传状态（染色质可及性和DNA甲基化）在移植前仍与天然胎肝和成体HSCs存在差异。EHT后的成熟过程是当前体外系统的主要瓶颈，涉及微环境信号缺失（如MYCT1快速丢失）、机械代谢成熟不足（剪切应力诱导的线粒体重塑和氧化磷酸化能力获得）以及静脉窦状隙微环境缺失等问题。

五、讨论与结论

讨论部分指出，当前体外分化方案能可靠诱导动脉内皮身份和生血程序，但细胞进入正常由胎盘和/或胎肝环境支持的成熟阶段时即遭遇瓶颈。表面标志物如PROM1（CD133）和HLA?DRA仅在iHSCs获得微环境样线索和充分成熟时间后才出现。发育研究提示，胎盘滋养层来源的因子（PDGF-B、HGF/c-met）可调节HSC存活和行为，而机械刺激（早期胚胎心跳和血液循环产生的剪切应力）通过PI3K–Akt–mTOR通路诱导线粒体重塑，增加氧化磷酸化能力，这一代谢状态的获得是长期多谱系植入所必需的，且无法仅通过转录特化实现。研究人员主张，未来的成熟环境需重新设计以反映体内发生的序贯转变，并建立整合转录、表观遗传、代谢和功能多层面的基准评估框架。结论部分强调，将体内发育原理与工程化hPSC系统深度整合，可加速生成功能完全成熟的人类HSCs，为细胞和基因治疗以及先天性白血病、遗传性骨髓衰竭综合征和年龄相关造血衰退等疾病建模提供有力工具。