ARID1A与ARID1B协同维持B细胞谱系保真并抑制小鼠髓系转化

《Experimental Hematology》：Arid1a and Arid1b maintain B cell lineage fidelity and constrain myeloid transformation in mice

　　

摘要专业翻译 哺乳动物SWI/SNF（mSWI/SNF）复合物是ATP依赖的染色质重塑因子，可调控核小体定位、染色质可及性与转录状态。经典BAF复合物包含互为排斥的核心亚基ARID1A或ARID1B。在人类癌症中，多种mSWI/SNF组分发挥肿瘤抑制功能，其突变频率与谱系在不同组织及肿瘤类型间差异显著，提示各亚基具有环境与谱系依赖性的功能。染色质调控因子是造血谱系定向与分化的关键决定因素。ARID1A与ARID1B在造血干/祖细胞（HSPCs）中高表达，且在B细胞来源的恶性肿瘤中频繁突变，联合突变率约20%，远高于骨髓增生异常综合征或急性髓系白血病中的2%–3%。然而，ARID1A与ARID1B如何跨谱系参与造血转化仍未完全阐明。本研究利用基因工程小鼠模型，通过CD19-Cre条件性敲除Arid1a与Arid1b，系统研究了二者在B细胞发育、生发中心（GC）反应、造血祖细胞功能及恶性转化中的作用。研究结果揭示了ARID1A与ARID1B在B细胞发育中的重叠功能，并发现这些经典BAF亚基在维持造血谱系保真方面具有出乎意料的关键作用。联合缺失改变了多能祖细胞组成与转录谱系程序，最终导致可移植的髓系恶性肿瘤，表明染色质重塑机制的破坏可使突变发生的谱系与最终癌症所呈现的谱系发生解偶联。

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一、研究背景与科学问题

哺乳动物SWI/SNF（mSWI/SNF）染色质重塑复合物通过ATP依赖的方式调控核小体定位、染色质可及性及转录状态，是细胞命运决定和谱系维持的关键表观遗传调控机器。经典BAF复合物以ARID1A或ARID1B作为互斥的核心亚基。在人类肿瘤中，mSWI/SNF多个组分被鉴定为肿瘤抑制因子，其突变频率和突变谱在不同组织与肿瘤类型间差异显著，提示各亚基具有环境和谱系依赖性的功能。在血液系统恶性肿瘤中，ARID1A与ARID1B在B细胞来源的肿瘤中突变率合计约20%，而在骨髓增生异常综合征或急性髓系白血病中仅为2%–3%，这种显著差异提示二者在B细胞谱系中具有更为关键的作用。

然而，现有研究仍存在若干悬而未决的问题：第一，ARID1A和ARID1B在B细胞早期分化阶段的功能尚未被系统阐明；第二，二者之间是否存在功能冗余或各自独立的功能尚不清楚；第三，二者联合缺失对造血谱系稳定性和恶性转化的影响此前从未被研究。既往基于HSC启动的Arid1a缺失研究虽观察到B细胞输出受损，但由于缺失起始于HSC阶段，无法区分是B细胞祖细胞的内在缺陷还是更早期祖细胞的扰动所致。此外，单独缺失Arid1a或Arid1b均未在既有模型中导致明显的恶性转化。因此，研究人员利用CD19-Cre驱动的条件性敲除模型，在B细胞谱系内特异性地研究ARID1A与ARID1B的发育功能及其对恶性转化的影响。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员构建了CD19-Cre驱动的Arid1a和/或Arid1b条件性敲除小鼠模型，全部小鼠均回交至C57Bl/6背景。主要技术方法包括：流式细胞术分析外周血、骨髓和脾脏中各造血细胞群体的组成与数量；羊红细胞（SRBC）免疫模型结合流式细胞术和PNA/Ki67免疫组化评估生发中心（GC）反应；全骨髓移植实验验证疾病的移植性；RNA测序（RNA-seq）结合limma差异表达分析和GAGE基因集富集分析，以及加权基因共表达网络分析（WGCNA）解析MPP2/3细胞的转录组变化；体外髓系集落形成实验评估祖细胞功能；CD19-Cre与Lox-Stop-Lox TdTomato报告小鼠杂交进行谱系示踪。所有小鼠均来自华盛顿大学圣路易斯分校实验动物管理委员会批准的方案。

三、研究结果

Arid1a和Arid1b缺失损害骨髓中的B细胞分化

通过CD19-Cre条件性敲除模型，研究人员发现单独缺失Arid1a或Arid1b均导致骨髓中B细胞发育向早期阶段偏移，表现为pro B和/或pre B细胞比例增加，同时未成熟B细胞和再循环B细胞（B220?IgM^high）减少。联合缺失Arid1a/Arid1b后，外周血白细胞总数显著下降，主要反映为外周B细胞减少，且未成熟和再循环B细胞的减少更为显著，提示存在部分分化阻滞和/或存活或迁移异常。Cre阴性对照小鼠证实floxed等位基因本身不影响ARID1A/ARID1B蛋白表达和B细胞输出。

Arid1a和Arid1b对生发中心有效扩增是必需的

研究人员对8周龄小鼠进行SRBC免疫，9天后分析脾脏GC反应。结果显示，单独缺失Arid1a或Arid1b均导致FAS?GL7?GC B细胞频率显著降低，GC面积占脾脏总面积比例也显著下降。联合缺失小鼠的GC反应比单独敲除更为微弱，PNA阳性面积和Ki67阳性面积均显著减少，提示两个同源基因在GC反应中存在部分功能冗余。

Arid1a和Arid1b联合缺失导致可移植的髓系恶性肿瘤

长期观察（最长2年）显示，联合敲除小鼠从3月龄起死亡率显著增加，单独敲除小鼠从9月龄起死亡率增加。濒死双敲除小鼠出现脾肿大。流式细胞术意外发现，扩增的异常细胞群不表达B细胞标志物CD19、B220、IgM和IgD，而表达c-Kit、CD43、Mac1和Gr1等未成熟和髓系标志物。免疫组化显示脾脏中Ki67和c-Kit广泛阳性。将患病小鼠骨髓移植至亚致死辐照的CD45.1受体后，供体来源细胞成功植入并保留CD43?Mac1?Gr1?髓系免疫表型，且B220表达极低，证实该疾病具有移植性。骨髓中Lin?CD45.2?造血干/祖细胞分析显示MPP2/3亚群选择性扩增。综合证据支持该表型为可移植的未成熟髓系白血病。

CD19-Cre标记一部分多能祖细胞，其组成受Arid1a/Arid1b缺失影响

鉴于意外的髓系表型，研究人员假设CD19-Cre可能在具有髓系潜能的MPP亚群中有活性。通过CD19-Cre与Lox-Stop-Lox TdTomato报告小鼠杂交，发现约9%的MPP2和3%的MPP3细胞被标记，而LT-HSC、ST-HSC和MPP4中标记极少。PCR分析证实MPP2/3细胞中floxed Arid1a和Arid1b等位基因发生重组。对8–12月龄双敲除小鼠骨髓的分析显示，MPP4比例显著降低，MPP3绝对数量显著增加，而MPP2无显著变化，提示MPP区室的选择性改变而非普遍性扩增。体外集落形成实验显示，Arid1a/Arid1b缺失的MPP2/3细胞形成的集落数量显著减少，表明其髓红系集落形成能力受损。

Arid1a和Arid1b缺失破坏MPP中的谱系相关转录程序

对MPP2/3细胞进行RNA-seq分析发现广泛的基因表达变化。多个与HSPC身份相关的调控因子（Meis1、Pbx1、Lyl1、Hlf、Mecom、Erg、Hoxa9）表达下调，而红系分化相关基因（Klf1、Gata1、Tal1、Epor）表达上调，同时Gata2和Fli1表达降低。GAGE细胞类型转录特征分析显示，红系母细胞和巨核红系祖细胞程序富集，而HSC、多淋系祖细胞和B细胞相关特征耗竭。值得注意的是，成熟髓系相关特征同样被耗竭，包括Irf8和Csf1r表达降低，说明转录状态并非简单地获得成熟髓系程序。这些发现表明联合缺失导致正常祖细胞谱系程序失稳，表现为HSPC/淋系身份的丧失和异常红系偏向的谱系启动。

四、讨论与结论

本研究表明ARID1A和ARID1B在B细胞发育和GC反应中具有关键且部分重叠的功能。单独缺失任一亚基即可损害骨髓中早期B细胞分化和抗原刺激后的GC形成，联合缺失则暴露了显著的功能冗余，大幅降低B细胞输出并缩短生存期。最出乎意料的发现是，CD19-Cre介导的联合缺失最终导致具有髓系而非B细胞免疫表型的致死性可移植恶性肿瘤。CD19-Cre谱系示踪在MPP2和MPP3区室中检测到报告基因阳性细胞，且分选的MPP2/3细胞中检测到floxed等位基因重组，提示早期多能祖细胞可能是疾病的潜在来源。联合缺失导致MPP3选择性扩增、MPP4比例降低和髓红系集落形成能力受损，表明祖细胞区室受到实质性破坏。

转录组分析进一步支持正常祖细胞谱系身份的破坏。Arid1a/Arid1b缺失的MPP2/3细胞中，HSPC相关调控因子（Meis1、Pbx1、Lyl1等）表达降低，红系相关调控因子（Klf1、Gata1、Tal1、Epor）表达升高，细胞类型特征分析显示HSC和淋系程序耗竭、红系母细胞和巨核红系祖细胞程序富集，而成熟髓系程序并未富集反而普遍耗竭。因此，白血病前期转录状态并非向成熟髓系身份的简单转变，而是正常谱系相关转录程序的失稳和替代谱系状态的异常激活。研究人员指出，Meis1、Pbx1和Lyl1的降低应被理解为更广泛的HSPC转录程序丧失的一部分，红系程序的富集也不意味着红系命运承诺，因为最终恶性肿瘤是髓系的。这些发现提示ARID1A/ARID1B缺失的祖细胞在显性转化前经历了谱系保真的丧失。

结合近期发现的SMARCD家族亚基SWIFT结构域作为转录因子直接结合界面的机制研究，研究人员提出，mSWI/SNF复合物并非仅作为通用染色质重塑因子发挥作用，而是通过与谱系定义转录因子的选择性结合参与细胞状态特化。ARID1A和ARID1B的缺失可能破坏经典BAF复合物支持或稳定谱系特异性转录网络的能力，导致HSPC/淋系程序的丧失和异常替代谱系状态的出现。该研究还提示，尽管ARID1A和ARID1B在成熟B细胞淋巴瘤中频繁突变，但其缺失也可能破坏更早期的发育轨迹并使祖细胞倾向于替代命运，这种谱系特化和转化中的双重角色可能解释为何SWI/SNF突变可见于包括淋系和髓系在内的多种血液恶性肿瘤。此外，CD19-Cre在MPP中的早期重组事件对解读谱系特异性敲除模型和人类癌症的疾病异质性具有重要启示。