工程化水纳米结构（EWNSs）灭活日本柳杉花粉过敏原并减轻小鼠过敏性鼻炎

《Experimental and Molecular Pathology》：Engineered water nanostructures inactivate cedar pollen allergens and attenuate allergic rhinitis in murine models

　　

本研究证实了工程化水纳米结构（Engineered Water Nanostructures, EWNSs）——一种含有活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROS）的带电水纳米颗粒——是一种有效的非药理学工具，用于中和日本柳杉花粉过敏原。通过将花粉及其主要过敏原Cry j 1暴露于EWNSs，研究人员观察到在24小时内过敏原性显著降低，有效阻止了树突状细胞（Dendritic Cell, DC）活化，并抑制了促炎细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生。在BALB/c小鼠体内的试验表明，EWNS处理显著降低了免疫球蛋白E（IgE）水平，抑制了2型先天淋巴细胞（Type 2 Innate Lymphoid Cell, ILC2）的扩增，并减轻了嗜酸性粒细胞性气道炎症。此外，连续七天的EWNS吸入与更高的外周血氧饱和度（SpO2）和更低的Th2细胞因子表达相关，且在测量的终点指标中未观察到不良效应。这些发现支持了EWNS预处理可降低柳杉花粉制剂免疫反应性的潜力，并表明在所测试条件下，短期EWNS吸入具有抗炎关联效应。空气中花粉的灭活及全面的吸入安全性仍有待确定。

论文解读文章

研究背景与目的

过敏性疾病的全球流行已成为重大公共卫生问题。流行病学估计显示，全球超过2.6亿人患有支气管哮喘，约4亿人患有过敏性鼻炎。由花粉、尘螨和宠物皮屑等蛋白过敏原引发的过敏性鼻炎病例显著增加，导致的睡眠障碍、认知功能下降和体力活动受限造成了巨大的社会经济负担。目前的初级预防策略包括识别过敏原来源、抑制其传播以及通过口罩和护目镜等物理屏障减少人类暴露。在日本，政府推动以低花粉品种替换高花粉日本柳杉（Cryptomeria japonica）的举措已作为国家对策实施。然而，完全控制过敏原来源及其扩散仍然困难，物理防护措施效果有限，且可能干扰社交、职业和教育活动。二级预防和治疗方法，如抗组胺药、鼻内皮质类固醇和抗IgE抗体疗法虽被广泛使用，但长期用药可能导致不良反应和经济负担。因此，亟需新型的初级和二级预防策略。

本研究聚焦于工程化水纳米结构（EWNSs）作为一种潜在的新干预手段。EWNSs是通过对冷凝的大气水蒸气施加高压产生的不可见的带电水纳米颗粒，直径约为5-20 nm，含有高浓度的活性氧物种（ROS），特别是羟基自由基（•OH），能够诱导生物分子的氧化修饰和变性。既往研究表明EWNSs对大肠杆菌、流感病毒和SARS-CoV-2具有抗菌功效，但其对蛋白过敏原的影响及体内潜在的抗过敏活性尚不明确。本研究旨在探讨EWNSs的直接过敏原灭活（初级预防）和抗过敏（二级预防）效应，重点关注日本柳杉花粉及其主要过敏原Cry j 1。

主要关键技术方法

1. 1.
   EWNSs产生与暴露系统：采用静电雾化装置，通过珀尔帖元件冷却雾化电极使大气水蒸气冷凝，并在高电压下形成泰勒锥，产生带电荷的纳米级水滴（EWNSs）。将柳杉花粉提取物或完整花粉置于距发生器5 cm处，分别暴露1、24或72小时。
2. 2.
   体外树突状细胞（DC）活化评估：利用小鼠DC细胞系DC2.4和原代小鼠骨髓来源树突状细胞（mBMDCs），通过钙成像（Fura-2染色）、流式细胞术检测共刺激分子（CD80、CD86、MHC II）表达，以及ELISA和qRT-PCR检测促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的分泌与基因表达，评估EWNS处理后过敏原对DC的激活能力。
3. 3.
   小鼠过敏性鼻炎模型建立与分析：使用雌性BALB/c小鼠，通过腹腔注射Cry j 1与氢氧化铝佐剂进行致敏，随后连续七天经鼻滴注Cry j 1或完整花粉进行激发，构建过敏性鼻炎模型。通过脉搏血氧仪测量血氧饱和度（SpO₂），ELISA检测血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总IgE水平，流式细胞术分析肺组织中2型先天淋巴细胞（ILC2s）的比例以及淋巴结（LNs）中的免疫细胞亚群，组织病理学评估肺部炎症，并采用qRT-PCR检测肺组织中2型炎症相关细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-33）的基因表达。
4. 4.
   治疗性EWNS吸入实验：在小鼠过敏性鼻炎模型中，每次鼻内激发后，将小鼠置于全身吸入暴露系统中，吸入EWNSs 3小时/天，连续7天。同时监测臭氧（O₃）浓度作为副产物指标，并进行14天安全评估。

研究结果

3.1. EWNSs抑制柳杉花粉及完整柳杉花粉的过敏原性

通过Cry j 1特异性ELISA检测发现，经过24小时EWNS暴露后，花粉提取物中Cry j 1的ELISA反应性相比对照降低了超过99%。同样，完整花粉经72小时EWNS暴露后，其Cry j 1反应性也降低了超过99%。而总蛋白浓度在处理前后无明显变化，表明Cry j 1免疫反应性的降低并非由总蛋白的非特异性损失所致。

3.2. EWNS处理的柳杉花粉提取物体外降低DC活化

与对照提取物相比，EWNS处理的提取物刺激DC2.4细胞后，细胞内Ca²⁺内流显著减弱，CD11c⁺CD80⁺、CD11c⁺CD86⁺和CD11c⁺MHC II⁺的活化DC比例显著降低，IL-6和TNF-α的分泌量以及Il1b基因的表达水平也显著下降。在原代mBMDCs中也观察到了类似的Ca²⁺反应抑制效果。

3.3. EWNS处理的柳杉花粉提取物在小鼠过敏性鼻炎模型中的作用

在使用EWNS处理过的花粉提取物进行致敏和激发的模型中，与对照组相比，接受EWNS处理提取物的小鼠表现出更高的SpO₂，血清和BALF中总IgE水平显著降低，肺组织中ILC2s的比例显著下降。组织病理学分析显示，EWNS处理组的粘液细胞化生、支气管周围、血管周围和肺泡炎症以及巨噬细胞浸润均得到显著改善。BALF中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平也显著降低。淋巴结中的细胞浸润和促炎细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13、IL-17）产生同样受到抑制。肺组织中2型炎症相关细胞因子基因（Il4, Il5, Il6, Il13, Il33）的表达水平在EWNS处理组中更低。

3.4. 仅限于致敏或激发阶段的EWNS暴露在鼻炎小鼠模型中的效应

为了探究EWNS暴露的时间效应，研究人员在致敏阶段或激发阶段单独使用EWNS处理的花粉提取物。结果显示，无论是在致敏阶段、激发阶段还是两个阶段都使用EWNS处理提取物，均能显著提高SpO₂，降低血清和BALF中的总IgE水平。在致敏阶段使用EWNS处理提取物的小鼠，其肺组织ILC2s比例显著低于对照组。所有EWNS处理条件均能显著改善组织病理学病变，并正常化BALF中的细胞群体。淋巴结中的细胞浸润和细胞因子产生在几乎所有EWNS处理条件下均受到显著抑制。肺组织中2型细胞因子基因的表达在所有EWNS处理条件下均低于对照组。

3.5. EWNS处理的完整柳杉花粉在鼻炎小鼠模型中的效应

使用EWNS处理72小时的完整花粉进行的实验中，虽然SpO₂无显著变化，但在激发阶段使用EWNS处理花粉的小鼠，其BALF中嗜酸性粒细胞计数和MCP-1水平显著低于对照组。组织病理学分析显示EWNS处理可减轻花粉诱导的鼻炎相关病变。淋巴结中的细胞浸润在大多数EWNS处理条件下受到抑制。然而，整体基因表达和T细胞因子分泌的变化较为温和。

3.6. 为期七天的EWNS吸入在柳杉花粉提取物诱导的鼻炎小鼠模型中的治疗效果

在治疗性研究中，小鼠在每次鼻内激发后吸入EWNSs。结果显示，与对照组相比，EWNS吸入组小鼠的SpO₂显著更高，血清和BALF中的总IgE水平显著更低。虽然肺组织中ILC2s比例无显著差异，但2型炎症相关细胞因子基因（Il4, Il5, Il6, Il13, Il33）的表达水平显著降低。BALF中MCP-1和嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）的浓度也显著降低。组织病理学确认了EWNS吸入组中鼻炎相关病变的减轻。前期14天的安全评估未观察到不良效应。

讨论与结论

讨论总结：本研究表明，EWNSs能够降低气传过敏原的免疫反应性并减轻体内过敏性气道炎症。Cry j 1 ELISA反应性的显著降低表明抗原性丧失，而总蛋白浓度不变则排除了非特异性蛋白质降解的可能。考虑到EWNSs的ROS相关理化性质，氧化修饰或构象改变是可能的机制，但直接的生化证据仍需进一步研究。体外实验证实，EWNS处理后的过敏原对DC的激活能力显著减弱。在小鼠模型中，EWNS处理的花粉提取物显著改善了过敏性鼻炎的各项指标，包括降低IgE、抑制ILC2扩增和下调Th2细胞因子。值得注意的是，即使在致敏或激发单一阶段使用EWNS处理提取物也能发挥保护作用，这表明EWNSs兼具预防和治疗潜力。对于完整花粉的实验也验证了其降低过敏原性的效果。治疗性吸入实验显示，直接吸入EWNSs可在已建立的过敏性鼻炎模型中减轻炎症，且未观察到明显毒性，这可能与低剂量ROS的免疫调节作用有关。与传统的环境控制和药物治疗相比，EWNS提供了一种物理性的过敏原修饰方法。研究也存在局限性，如仅使用了雌性小鼠、吸入系统的定量表征不足、缺乏对空气悬浮花粉的直接灭活实验以及对Cry j 1分子变化的直接生化鉴定等。

研究结论翻译：

EWNS预处理柳杉花粉制剂降低了Cry j 1的ELISA反应性，并与小鼠模型中过敏性气道炎症的减轻相关。与对照提取物相比，EWNS处理的柳杉花粉提取物激活DC的能力较低，而给予EWNS处理过敏原的小鼠表现出比对照小鼠更低的Th2细胞因子表达和更不明显的ILC2相关免疫反应，这表明其在预防过敏性炎症方面具有潜在效果。短期EWNS吸入与小鼠模型中选定炎症终点的减轻相关；然而，定量的吸入EWNS/ROS剂量以及在暴露于空气传播花粉期间的效果仍未确定。在进行环境EWNS部署的有效性和安全性评估之前，还需要进一步的定量暴露特征描述、包含性别因素的研究以及直接的空气传播花粉共暴露实验。