RAD54在非同源末端连接受损的FaDu肿瘤细胞中抑制Theta介导的末端连接

《DNA Repair》：RAD54 Suppresses Theta-Mediated End Joining in Non-Homologous End Joining-Compromised FaDu Tumor Cells

　　•RAD54影响Cas9诱导DNA断裂的修复通路选择
•RAD54缺失会增加经典NHEJ被抑制时的致突变修复
•RAD54缺陷会增加带有模板化插入的缺失
•LIG4缺失会增加同源定向和theta介导的末端连接

引言

为维持基因组完整性，细胞已进化出多种通路来应对内源性来源（如氧自由基）和外源性来源（包括电离辐射，IR）产生的DNA损伤。DNA双链断裂（DSBs）对细胞构成挑战，因为DNA螺旋的两条链都受到影响。如果未修复或错误修复，DSB可导致细胞死亡或引发致癌转化的突变[1]。DSB可通过多种机制修复，包括经典非同源末端连接（NHEJ）、同源重组（HR）和替代末端连接通路。依赖于DNA聚合酶θ（Pol θ）的theta介导的末端连接（TMEJ）是一种重要的替代修复机制，可参与DSB修复，尤其是在其他修复通路受损时[2]。

在NHEJ中，Ku70-Ku80异源二聚体结合到DNA末端，导致额外NHEJ因子的积累，包括DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）、XRCC4和DNA连接酶IV（LIG4）[3]。XRCC4-LIG4复合物负责连接DNA末端[3,4]。NHEJ在DSB末端之间几乎没有或没有同源性（通常为0-4个碱基对，bps）的情况下运作[5]。尽管该通路快速恢复DNA的结构完整性，但它在修复过程中可能引入小缺失和插入[6,7]，代表一种多功能但中等易错机制。与NHEJ相反，HR是一种精确、高保真的修复通路，利用姐妹染色单体作为模板修复DSB。该过程仅发生在细胞周期的S和G2期。HR作用于被RPA结合的单链DNA（ssDNA）末端，BRCA2介导RPA被重组酶RAD51替代[8,9]。RAD54是一种DNA依赖性ATP酶，属于Swi2/Snf2家族，与RAD51包被的ssDNA丝相互作用，促进HR期间的链入侵和同源识别[10,11]。Rad54主动解旋双链DNA（dsDNA）模板，并引导RAD51-ssDNA丝沿姐妹染色单体DNA移动，以增强对同源模板的搜索[12]。第三个主要DSB修复通路TMEJ是微同源介导的末端连接（MMEJ）的一种形式。它作用于切除产生的ssDNA末端，利用2至20bps范围的微同源进行修复[13,14]。关键蛋白聚合酶θ（Pol θ）使用一个ssDNA末端的序列作为引物，而另一个相反方向的ssDNA末端作为模板[14]。利用TMEJ进行DSB修复是有代价的，因为它会导致突变[6,15,16]，使其比HR更易出错的修复机制。小缺失的发生是因为即使微同源位于DNA末端，修复不仅会移除微同源之间的DNA，还会删除两个原始微同源序列之一[17]。此外，TMEJ修复可以产生缺失，并插入从附近模板拷贝的短DNA序列，称为模板化插入。这是因为Pol θ可以将切除的单链DNA与附近序列对齐，并在完成修复前拷贝它，导致插入源自邻近DNA的序列。这一特征促成了TMEJ的致突变性质[18]。

NHEJ在分化真核细胞DSB修复中的重要性体现在NHEJ缺陷使它们对IR高度敏感[19,20,21]。而HR蛋白（如BRCA2）缺陷使分化细胞对IR敏感[22,23]，但缺乏Rad54的分化细胞和成年小鼠并未表现出IR敏感性[24]。有趣的是，缺乏Rad54的小鼠胚胎干细胞对IR的敏感性增加[25]。RAD54缺陷分化细胞的温和表型归因于RAD54B的存在，RAD54B是RAD54的旁系同源物[26,27,28,29,30]。RAD54和RAD54B都属于Swi2/Snf2 DNA依赖性ATP酶家族，序列相似性为63%[31]。在人类细胞中，RAD54B与RAD51和RAD54在细胞核中共定位[29]。然而，生化分析表明RAD54B的DNA依赖性ATP酶活性低于RAD54[28]。值得注意的是，当小鼠中的RAD54缺陷与NHEJ缺陷（如DNA-PKcs、Ku80或LIG4缺失）结合时，双突变小鼠比仅NHEJ缺陷的小鼠表现出更高的IR敏感性[24,32,33]。总之，这些发现表明RAD54在非分化细胞类型的DSB修复中起关键作用。而在分化细胞类型中，NHEJ成为主要的DSB修复通路，并补偿RAD54的遗传缺陷。分化细胞中的TMEJ缺陷导致对IR的轻度敏感性，表明TMEJ在DSB修复中发挥独立作用，而不仅仅作为备用通路[6,34,35,36,37]。然而，已有研究表明，当NHEJ或HR受损时，TMEJ会修复DSB[6,38,39]。

选择FaDu细胞作为人类头颈部鳞状细胞癌模型，以研究主要DSB修复通路在肿瘤细胞背景下如何相互作用，这对于放射治疗相关研究很重要。重要的是，单个修复通路的相对贡献可能取决于特定肿瘤模型的遗传背景和修复能力。因此，本研究旨在表征FaDu细胞中的通路相互作用，而不是建立跨肿瘤类型的通用DSB修复层级。

选择LIG4和RAD54分别研究经典NHEJ和RAD54依赖性HR。LIG4是经典NHEJ的末端连接因子，使其破坏是直接削弱有效末端连接的方法。RAD54促进RAD51依赖性同源搜索和HR期间的链入侵。其缺失提供了一个机会来研究RAD54依赖性修复减少如何影响替代通路的使用，尽管它并不一定消除所有HR活性。为了补充这些遗传扰动，我们使用DNA-PKcs抑制剂AZD7648，通过不同靶点功能性地抑制经典NHEJ。结合POLQ缺陷，这些模型使我们能够检查单个通路或组合通路受损时的修复结果。

在这里，我们通过结合遗传扰动、DNA-PKcs抑制、辐射存活分析、53BP1焦点分析和Cas9诱导修复结果的测序，研究了NHEJ、RAD54依赖性HR和TMEJ对FaDu细胞DNA损伤反应的贡献。辐射反应与特定Cas9诱导DSB处突变结果的比较，使我们能够区分全基因组辐射损伤的细胞反应与靶向断裂处的修复特征。特别地，我们研究了当NHEJ受损时，RAD54缺陷是否改变TMEJ的使用。我们的发现确定NHEJ是该模型中辐射存活的主要决定因素，并揭示了RAD54缺失后TMEJ相关突变特征的增加，尤其是在DNA-PKcs被抑制时。这些结果提供了对FaDu细胞中DSB修复通路相互作用的见解，同时认识到这些相互作用在其他肿瘤背景中的适用程度仍有待确定。

材料与方法

FaDu细胞（HTB-43，ATCC）在DMEM（4.5 g/L葡萄糖，含Ultraglutamine 1）与Ham's F-10的1:1混合物中培养，补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。所有细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中维持。

AZD7648[40]（MedChemExpress）以100 μM储备液溶于DMSO，按指示浓度使用。

pSpCas9(BB)-2A-Puro（PX459）V2.0质粒（由Feng Zhang馈赠，Addgene质粒#62988）用于Cas9和sgRNA表达。为生成靶向LIG4和RAD54序列的Cas9-sgRNA表达构建体，将带有靶序列和BbsI突出端的互补寡核苷酸（Integrated DNA Technologies）磷酸化、退火并克隆到BbsI消化的PX459 Cas9骨架质粒中。为构建靶向POLQ序列的Cas9-sgRNA表达载体，将两个带有靶序列和与PX459兼容突出端的互补寡核苷酸用于PCR，以PX459的AflIII-XbaI片段为模板。所得PCR产物通过Gibson Assembly克隆到PX459的XbaI-AflIII片段中。靶序列概述见表1。用于分析Cas9诱导突变特征并包含靶向HPRT基因sgRNA（sgHPRT_ex3.2、sgHPRT_ex4、sgHPRT_ex7）的Cas9-WT-2A-mCherry质粒已在[7]中描述。

转染前一天，将1,000,000个细胞接种在6孔板中。转染前，将培养基更换为含10%胎牛血清的DMEM（4.5 g/L葡萄糖，含Ultraglutamine 1）。转染混合物通过混合7.5 μL Lipofectamine? 3000转染试剂（Invitrogen）、2.5 μg DNA和5 μL P3000?试剂（Invitrogen）制备。细胞孵育过夜，然后更换为正常培养基。

为生成LIG4-/-、RAD54-/-和POLQ-/- FaDu细胞，将WT FaDu细胞转染含有一个sgRNA（RAD54、LIG4）的质粒或含有两个sgRNA（POLQ）的质粒。转染后一天加入嘌呤霉素（200 μg/mL），细胞在选择条件下维持5天。从嘌呤霉素抗性克隆中分离DNA，通过PCR对克隆进行基因分型，选择缺失LIG4编码序列、RAD54启动子或POLQ启动子的克隆。随后，对LIG4-/-和POLQ-/- FaDu细胞，将覆盖LIG4外显子或POLQ外显子2靶向位点的PCR产物送去Sanger测序，以确认其基因型。完全纯合缺失效率较低；鉴于NHEJ是FaDu细胞中的主要DSB修复机制，DNA连接跨两个DSB可能发生而非缺失中间片段，提示DNA-PKcs抑制可能进一步提高敲除效率[41]。

末端连接实验按[42]中所述进行。简言之，将细胞以300,000个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并用1 μM AZD7648或DMSO孵育。第二天，按照针对贴壁细胞的制造商方案，使用Lipofectamine? 3000转染试剂（Invitrogen）将2 μg线性DNA底物（pDVG94）转染细胞。转染后两天，提取染色体外DNA[43]，并重悬于20 μL Milli-Q的最终体积中。PCR扩增连接的pDVG94 DNA，并用BstXI消化PCR产物。消化的PCR产物在含溴化乙锭的6%聚丙烯酰胺凝胶中分离，在TBE缓冲液中电泳。

制备细胞裂解物前一天，将细胞接种并孵育过夜。对于结合照射和AZD7648的实验，细胞在照射前1小时用0.1 μM AZD7648处理，照射剂量为8 Gy，并在照射后1小时收集细胞裂解物。为制备裂解物，用冷PBS（Lonza）洗涤细胞，从培养皿中刮下，并在Laemmli缓冲液（4% SDS、20%甘油、120 mM Tris）中于95°C孵育5分钟以裂解。然后用注射器剪切样品以降低粘度。使用Lowry测定[44]确定蛋白质浓度。通过添加上样缓冲液（最终浓度0.01%溴酚蓝和0.5% β-巯基乙醇）制备样品，并加载到SDS-PAGE凝胶（RAD54和β-肌动蛋白）或PVDF转移膜（0.45 μm孔径，Immobilon-P，Millipore；磷酸化DNA-PKcs和Vinculin）上。通过印迹将蛋白质转移到Odyssey Immobilin-P转移膜（Millipore）上，在4°C下以300 mA转移2小时，使用转移缓冲液（0.4 M甘氨酸、5 mM Tris、20%甲醇）。转移后，在室温（RT）下用封闭缓冲液（3%脱脂奶粉、0.05% Tween-20于PBS中）封闭膜1小时。然后，将膜与一抗（小鼠抗RAD54（1:100，F-11 sc374598，Santa Cruz）、小鼠抗β-肌动蛋白克隆C4（1:500,000，MAB1501R，Millipore）、兔抗磷酸化DNA-PKcs（Cell Signaling Technology，68716S，1:1,000）、兔抗Vinculin（Abcam，ab129002，1:10,000））在封闭缓冲液中于4°C孵育过夜。用0.05% Tween-20于PBS中洗涤后，将膜与二抗（HRP标记的抗小鼠或抗兔，Jackson ImmunoResearch Labs，1:2000）在封闭缓冲液中于RT孵育1.5小时。洗涤后，向印迹加入增强化学发光底物（自制），使用Amersham Imager 600（GE Healthcare）测量化学发光。

照射使用Xstrahl RS320 X射线发生器进行，195 kV X射线（10 mA，0.5 mm Cu滤片）。

将细胞以不同密度接种在60 mm培养皿中，三份重复。6-8小时后，细胞接受X射线剂量2、4和6 Gy照射或不处理。选择这些剂量以评估一系列辐射暴露下的细胞存活，并比较不同基因型细胞系的放射敏感性。为了评估经X射线辐射和NHEJ抑制剂处理的细胞的克隆存活能力，在辐射前1小时向细胞中加入0.1 μM AZD7648或DMSO，并将抑制剂留在细胞上24小时。14-16天后，用考马斯亮蓝染色液（50%甲醇、7%乙酸和0.1%亮蓝R）固定并染色细胞，使用GelCount菌落计数器（Oxford Optronix）或人工计数菌落。

细胞以每孔5,000或20,000个细胞的密度接种于24孔板中，一式三份，接种密度取决于细胞系的生长速率。次日，细胞接受0.25、0.5、0.75、1和2 Gy的X射线剂量照射，或不处理。由于LIG4敲除导致高放射敏感性，因此选择较低的X射线剂量以适应其对辐射的敏感性增加，并在多种剂量范围内实现对细胞存活的有意义评估。辐射后，每3至4天更换一次培养液，持续14天。随后用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，并用0.05%结晶紫（Sigma-Aldrich）水溶液染色30分钟。染色后，用水洗涤培养板并干燥。进行定量时，向培养板中加入甲醇并孵育15分钟。然后，将每孔100 μL转移至96孔板，使用Spectramax iD3（Molecular Devices）在540 nm处测量吸光度。

细胞以每孔300,000个细胞的密度接种于含18 mm盖玻片的6孔板中。次日，细胞接受2 Gy X射线剂量照射，对照组不处理。选择此X射线剂量用于病灶评估，以在诱导可检测的DNA双链断裂的同时最大程度减少细胞死亡，从而能够评估病灶随时间的变化。对于辐射联合AZD7648的实验，在辐射前1小时开始用0.1 μM AZD7648处理细胞，并在辐射后维持抑制剂24小时。在辐射后指定时间点，用PBS洗涤细胞并用4%多聚甲醛固定。时间进程包括用于评估病灶形成的早期时间点，以及长达24小时的中间和晚期时间点，以追踪辐射诱导的53BP1病灶的消退。24小时时间点用于评估辐射后第一天内损伤相关病灶的持续性。该实验并非旨在确定较晚时间点完全消退所需的时间。

用0.1% Triton X-100透化细胞，并用PBS+缓冲液（含5 mg牛血清白蛋白（BSA）和1.5 mg甘氨酸/mL PBS）封闭。一抗（53BP1；NB100-304；Novus Biologicals）以1:1,000比例稀释于PBS+缓冲液中，与细胞在4°C下孵育过夜。次日，再次用0.1% Triton X-100透化细胞，并用PBS+缓冲液洗涤。二抗（Alexa488；Life Technologies）以1:1,000比例稀释于PBS+缓冲液中，在室温避光条件下处理细胞1小时。最后，使用含DAPI的抗淬灭封片剂（Vectashield）将盖玻片封片于显微镜载玻片上，并用指甲油密封。

使用Leica STELLARIS 5共聚焦显微镜进行细胞免疫荧光观察，采用以下激光线：DAPI（405 nm）和Alexa488（488 nm）。每个样本用40x物镜捕获5-8张Z轴层扫图像。然后生成Z轴投影，并基于DAPI信号对细胞核进行分割。使用自制ImageJ脚本分析每个细胞核中53BP1病灶的数量。简言之，为每个细胞核创建单独的分割掩膜，并使用基于53BP1信号均值+因子×标准差设定的阈值生成病灶掩膜[45]。使用ImageJ中的测量功能对分割的病灶进行定量。

用表达指示sgRNA的Cas9-WT-2A-mCherry构建体转染细胞。在转染前1小时加入1 μM AZD7648或DMSO，并使其在细胞上保留5天。转染后七天，用5 μg/mL 6-硫代鸟嘌呤对细胞进行筛选，持续6天，之后分离DNA。通过将接种于6孔板中的细胞与裂解缓冲液（100 mM Tris pH 8.5、5 mM EDTA、200 mM NaCl、0.2% SDS、0.1 mg/mL蛋白酶K）在37°C下孵育过夜来提取基因组DNA。然后加入两倍体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡5分钟，以1,000 rpm离心10分钟。将水相转移至新管中，加入两倍体积的乙醇。样品在-20°C下孵育过夜，以1,000 rpm离心10分钟沉淀DNA，然后重悬于Milli-Q水中。根据先前描述的方法[46]制备用于Illumina测序的样品并进行测序，分析Cas9诱导的修复结果。为去除PCR和测序错误导致的突变结果事件，排除读取数少于30的事件。此外，如果模板化插入缺失的缺失长度加上相对于右侧断裂位点的插入位置之和等于0或1，且缺失长度减去插入大小等于0或1，则将其移除。使用SIQPlotteR可视化数据并生成每种基因型的突变谱图[47]。使用WT、LIG4?/?、RAD54?/?和POLQ?/? FaDu细胞进行了三次实验。此外，还使用WT、RAD54?/?和POLQ?/? FaDu细胞，在有无AZD7648处理以及LIG4?/? FaDu细胞条件下进行了两次实验。

章节片段

缺失LIG4、RAD54或Pol ?的FaDu细胞的生成与表征

为了研究缺乏DSB修复蛋白的FaDu细胞的表型，我们创建了缺失NHEJ蛋白LIG4、HR蛋白RAD54或TMEJ蛋白Pol θ的敲除（KO）细胞系。采用CRISPR-Cas9系统生成这些KO细胞系，每个基因设计了两个单链引导RNA（sgRNA），以删除编码序列或启动子（图1A）。其中一个sgRNA靶向第一个外显子之一，通过诱导产生KO。

讨论

我们的研究表明，NHEJ是FaDu细胞中X射线辐射和Cas9诱导的DSB的主要修复通路。这一结论得到以下证据支持：LIG4缺陷细胞和DNA-PKcs抑制剂AZD7648处理的细胞表现出超敏反应和延迟的53BP1病灶消退，以及Cas9诱导DSB后突变结果的显著改变。这些发现强调了FaDu肿瘤细胞在DNA损伤条件下对NHEJ存活的依赖性，与以下结论一致。

局限性

在解读这些发现时，应考虑若干局限性。首先，本研究仅在单一人类肿瘤细胞系FaDu中进行，NHEJ、HR和TMEJ的相对贡献在其他肿瘤背景下可能有所不同。在额外头颈癌模型中进行验证对于确立观察到的通路相互作用的普遍性非常重要。其次，电离辐射产生异质性的DNA损伤谱，因此所导致的存活和损伤反应

总体见解

我们的研究结果凸显了NHEJ在FaDu细胞中IR诱导DSB修复中的主导作用。它们还强调了当其他DSB修复通路受损时，TMEJ作为补偿性修复机制的重要性，因为在缺乏NHEJ或HR的细胞中，突变结果主要源于TMEJ活性。RAD54缺失后未观察到放射敏感性增加，不应被解读为HR对辐射诱导DSB的修复可有可无。RAD54缺乏并不

资金

本研究由荷兰癌症协会（INTO-PROT，12092/2018）和Varian（PROTON-DDR，2019020）资助。它也是Oncode研究所的一部分，该研究所从荷兰癌症协会获得部分资金。

CRediT作者贡献声明

Gerarda van de Kamp：写作-初稿，可视化，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。Joost Schimmel：写作-审阅与编辑，资源，方法学，调查，数据管理。Tim Heemskerk：调查。Anna Hegger：调查，正式分析，数据管理。Marianne Kersten：调查，正式分析，数据管理。Nicole Verkaik：调查。Roland Kanaar：写作-审阅与编辑，监督，资金

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Jeroen Essers报告称Erasmus MC提供了资金支持。Jeroen Essers报告与KWF荷兰癌症协会存在关系，包括：资助拨款。如果有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本论文所报告的工作。

Gerarda van de Kamp|Joost Schimmel|Tim Heemskerk|Anna Hegger|Marianne Kersten|Nicole Verkaik|Roland Kanaar|Marcel Tijsterman|Jeroen Essers