引言
由内源性代谢物和外源性烷化剂引起的 DNA 烷基化会产生广泛的甲基化和乙基化碱基损伤，如果得不到修复，这些损伤会损害基因组稳定性并促进肿瘤发生 [1], [2], [3], [4]。为了对抗这种损伤，哺乳动物细胞采用多种修复途径，包括由 DNA 糖基化酶启动的碱基切除修复、由 O?-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶进行的直接逆转，以及由 AlkB 样 Fe(II)/α-酮戊二酸(αKG)依赖性双加氧酶介导的氧化去甲基化 [2], [3], [5], [6], [7]。
人 AlkB 同源物 2 (ABH2, ALKBH2) 是一种关键的双加氧酶，可高效去除 DNA 上的烷基修饰，优先作用于含有 N1-甲基腺嘌呤 (m1A) 和 N3-甲基胞嘧啶 (m3C) 等损伤的双链底物，以及许多其他底物 [5], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]。结构和生化研究表明，ABH2 具有 AlkB 家族典型保守的双链 β-螺旋（果冻卷）折叠，同时利用额外的氨基酸环区，这构成了其对双链 DNA (dsDNA) 的显著偏好 [15], [16], [18]。
ABH2 的一个显著特征是在由残基 Val101、Phe102 和 Gly103 构成的疏水性“指”结构，该结构插入 DNA 双链中，填充由翻转出的靶碱基形成的空腔，并将损伤位点稳定在活性位点口袋内 [15], [16]。双链的进一步稳定和损伤链的正确定位涉及带正电环区的定位，包括 RKK 环 (Arg241, Lys242, Lys243) 和一个包含残基 Arg198、Arg203 和 Lys205 的柔性 DNA 结合环，该环与损伤链的互补链形成接触 [15], [16], [17]。催化位点由典型的 His171–Asp173–His236 三联体组织，该三联体协调 Fe2? 离子，同时残基 Tyr161 和 Arg248 结合 αKG 共底物，残基 Tyr122、Phe124 和 Glu175 塑造底物结合腔 [19]。
积累的数据表明，ABH2 表达和功能的失调有助于多种恶性肿瘤的发展，并调节细胞对烷基化化疗的反应 [20], [21]。ABH2 活性降低 [22] 或表达水平降低 [23], [24] 可增加肿瘤细胞对烷基化药物的敏感性，而过表达可能促进耐药性 [25], [26], [27]，凸显了 ABH2 作为潜在生物标志物和治疗靶点的价值。同时，ABH2 基因的遗传性或体细胞突变可导致氨基酸替换，改变酶稳定性、底物结合、辅因子协调和整体修复效率，从而影响个体对癌症的易感性和治疗结果 [22], [28], [29]。
此前我们实验室使用多种预测工具对 ABH2 基因的 200 多个错义单核苷酸变异 (SNVs) 进行了全面的计算机分析 [30]，这使我们能够识别出一组具有高概率有害功能影响的变异。将这些替换映射到 ABH2-DNA 复合物上，提出了几种机制情景，包括疏水性“指”和“核苷酸识别盖”的扰动、Fe2? 离子或 αKG 协调的破坏，以及形成活性位点口袋和 DNA 结合表面的环区的去稳定化。然而，对于大多数已知的错义变异，其对催化活性、对含 m1A 和 m3C DNA 的底物特异性以及蛋白质结构稳定性的预测影响的实验验证仍然有限。
在本研究中，我们对先前预测对酶活性有显著负面影响的人 ABH2 的若干选定错义变异进行了详细的功能表征。通过结合对含 m1A 和 m3C DNA 底物的催化效率的定量测定、结合效率分析以及使用圆二色 (CD) 光谱和热变性的整体表征，我们直接评估了天然存在的氨基酸替换如何重塑 ABH2 的催化景观和结构稳定性。这些数据为一些 ABH2 SNVs 的功能后果提供了机制见解，并有助于在 ABH2 酶天然变异的 DNA 修复能力背景下完善对生物信息学预测的解释。
Viktoriia V. Sagalakova|Anastasiia T. Davletgildeeva|Viktoriia A. Kolesnikova|Nikita A. Kuznetsov
