基于肝细胞的CYP450代谢分数测定模型：来自IQ联盟定量代谢分数工作组的建议

《Drug Metabolism and Disposition》：Hepatocyte-Based Models for CYP450 Fraction Metabolized Determination: Recommendations from the Quantitative Fraction Metabolized IQ Consortium Working Group

　　摘要药物代谢酶（DMEs）介导的代谢分数（fm）的准确定量对于理解清除机制、预测个体间差异以及评估药物发现和开发过程中受害药物-药物相互作用（DDI）风险至关重要。特别是，对于代谢稳定、低周转率化合物，确定fm仍然具有挑战性。传统的体外系统——如人肝微粒体（HLM）、肝细胞悬液和重组酶——通常缺乏长时间孵育以检测低周转率化合物母体消耗的能力，导致清除率测量和DDI预测不准确。包括肝细胞接力法、共培养肝细胞系统（HepatoPac和HuREL）以及三维球体培养在内的技术进步，使得低周转率化合物能够进行长时间孵育。然而，缺乏系统的跨平台评估、关于抑制剂选择性和稳定性的不确定性以及长期培养性能的变异性，继续限制了对fm估计的信心。

为研究这些空白，国际药物开发创新与质量联盟（IQ）成立了定量代谢分数工作组，以评估用于fm测定的长期体外平台。研究选择了具有充分表征的人体吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征的底物，以及诱导作用或细胞毒性最小的选择性细胞色素P450（CYP）抑制剂，在四个系统中进行抑制研究：HepatoPac、HuREL、球体和接力法。本文总结了这些比较研究的结果，重点介绍了系统性能、fm估计值以及方法学考量和挑战。总的来说，这些发现表明，将长期肝细胞系统可靠地应用于反应表型分析并转化为临床DDI预测，需要进一步表征每个模型系统中的底物动力学、抑制剂效力和选择性、诱导潜力以及代谢途径代表性。

引言在整个小分子药物发现和开发过程中，准确估计代谢分数（fm）至关重要，因为它支持清除机制（代谢性和非代谢性）的表征、个体间差异的预测以及受害药物DDI的评估。不准确的fm估计可能导致不必要的临床DDI研究、过度严格的药品说明书，或更令人担忧的是遗漏安全风险。随着候选药物越来越多地表现出复杂的代谢途径，包括细胞色素P450（CYP）和非CYP酶的贡献，可靠的fm定量方法对于发现和开发阶段的决策至关重要。1, 2 在这一不断发展的背景下，低周转率化合物日益普遍，因为优化代谢稳定性可以降低剂量、延长全身暴露并支持减少给药频率。然而，正是这些化合物所具有的低周转率特性使其具有吸引力，同时也使其代谢途径——因此其fm值——难以使用常规体外系统进行定量。

传统上，fm的估计依赖于简单的体外平台，如重组酶、人肝微粒体（HLM）和肝细胞悬液，通常与选择性化学抑制剂联合使用。这些方法已广泛用于反应表型分析，并构成了生理药代动力学（PBPK）建模和客体DDI风险评估的基础。3, 4 虽然这些方法通常对中等至高清除率的药物有效，但不太适用于代谢稳定或低周转率化合物（即，基于标准4-6小时肝细胞悬液（0.5 × 10^6个细胞/mL）中最小可检测的20%消耗，< 3 μL/min/10^6个细胞5, 6）。需要持续酶活性并延长孵育时间以及检测大量代谢物的低周转率化合物是传统孵育系统中的关键挑战。7

在用于确定fm的更广泛框架内，在人肝细胞中进行的选择性化学抑制研究仍然是反应表型分析和量化酶贡献的基石方法。虽然补充方法，如siRNA介导的酶敲低8和基因型或表达多态性的生物试剂，可以提供酶参与的额外证据，但这些方法通常被视为用于验证和细化酶贡献估计的正交证据。将化学抑制扩展到长期肝细胞模型，提供了将既定方法应用于需要延长孵育期以可靠确定fm的低周转率化合物的潜力。

肝细胞接力法9, 10，共培养肝细胞系统如HepatoPac11, 12和HuREL12, 13，以及其他长期模型如三维肝细胞球体6, 14, 15, 16，允许在延长的孵育期内测量固有清除率和代谢物形成，从而能够评估低周转率化合物。此外，这些测定法在反应表型分析中的效用也已被探索。例如，在HepatoPac中验证选择性CYP抑制剂——如伊曲康唑（CYP3A）和奎尼丁（CYP2D6）——得出的fm估计值在体内数据的两倍范围内。17, 18

尽管技术进步使得肝细胞能够孵育多天，但在准确定量代谢稳定（低周转率）化合物的fm方面仍然存在相当大的障碍。除了酶持久性丧失外，其他问题包括可重复性和跨系统一致性差，而全面的多平台评估仍然很少。19 这些局限性削弱了临床前客体DDI风险评估的信心，往往导致依赖昂贵的临床研究，强调需要标准化方法和行业基准来确定低周转率化合物的fm。虽然各种系统已被评估用于反应表型分析目的，但我们的文献综述未发现任何针对主要药物代谢酶fm估计的系统性跨系统比较。

为了应对当前挑战并系统评估目前可用的fm测定工具，成立了国际药物开发创新与质量联盟（IQ，www.iqconsortium.org）定量代谢分数工作组。该IQ工作组由来自16家公司的17名成员组成。主要目标是通过既有和创新方法，为低周转率药物定量体外评估代谢分数奠定行业标准基础。最初，工作组根据全面的人体ADME数据的可用性，选择了成熟的CYP探针底物用于表型分析研究。随后选择抑制剂，以确保其对单个CYP酶的特异性，并最大限度地减少长期培养系统中酶诱导和细胞毒性的可能性。此后，在四个模型系统——肝细胞悬液接力法、球体、HepatoPac和HuREL——中进行抑制研究，以评估这些平台用于反应表型分析的适用性，特别是针对低周转率化合物。在使用选择性底物-抑制剂对建立每个肝细胞系统性能稳健性后，使用母体消耗和代谢物形成方法，对两种化合物（瑞格列奈和地西泮）在肝细胞系统中进行了全面评估，以确定主要CYP的fm。

数据与文献中可用的体内数据进行比较，以评估所评估的肝细胞系统的稳健性。本文介绍了这些比较研究的结果，包括通过这些系统确定fm。此外，我们讨论了方法学考量、局限性，并提供了非强制性的建议，以量化关键CYP异构体的fm。

章节片段

化学品和试剂
HepatoPac培养系统购自BioIVT（Westbury，NY），HuREL共培养物购自MatTek/Sartorius（Ashland，MA）。用于球体培养和接力法的肝细胞购自BioIVT。关于肝细胞系统的其他详细信息可在补充表1中找到。4'-羟基瑞格列奈购自Enamine（Monmouth Junction，NY）。20 各公司从其首选商业供应商处采购所有其他化学品和材料。所有人体来源的生物材料……

原代人肝细胞（PHH）培养系统的选择
研究选择了四个肝细胞系统：（1）PHH-小鼠成纤维细胞共培养系统（HepatoPac），（2）PHH-小鼠基质共培养系统（HuREL），（3）三维PHH球体培养（球体），以及（4）使用接力法悬浮培养的原代人肝细胞（接力法）。选择这些肝细胞系统是基于其已发表的功能表征以及先前在低清除率化合物定量fm测定中的使用。6, 11, 17, 18, 22

CYP化学抑制剂和探针反应的选择
典型的……

讨论
对四个肝细胞系统的研究发现，总体CYP活性和化学抑制剂的有效性均存在差异。基于测得的探针底物消耗和CYP特异性代谢物形成速率，与其他评估系统相比，接力法系统表现出更高的CYP活性（表2和补充表8）。这可能符合预期，因为接力法系统中的肝细胞在功能上等同于新鲜悬浮的肝细胞，其中CYP活性……

结论
总体而言，本研究的发现表明，CYP特异性抑制剂可以有效地整合到低周转率测定平台中，以促进低清除率化合物的反应表型分析。然而，数据不支持普遍推荐单一方法供一般使用；相反，最佳方法和条件应根据测试药物的代谢特征、肝细胞模型的适用性以及……

利益冲突
作者声明无利益冲突。

数据可用性声明
作者声明，支持本研究结果的所有数据均可在本文及其补充材料中获取。

CRediT作者贡献声明
Angela C. Doran：概念化、数据管理、正式分析、调查、方法学、可视化、写作-审阅/编辑。Vincent C. Peterkin：概念化、数据管理、正式分析、调查、方法学、可视化、写作-初稿、写作-审阅/编辑。Lilian H.J. Richter：概念化、数据管理、正式分析、方法学、写作-审阅/编辑。Helen Tracey：数据管理、正式分析、方法学、写作-初稿、未引用参考文献45.；45.。

致谢
本手稿在国际药物开发创新与质量联盟（IQ，[链接] www.iqconsortium.org）的支持下编写。IQ是一个由制药和生物技术公司组成的非营利组织，其使命是推动科学技术发展，以增强成员公司开发变革性解决方案的能力，从而惠及患者、监管机构和更广泛的研究与开发社区。作者谨此感谢……

Angela C. Doran|Vincent C. Peterkin|Lilian H.J. Richter|Helen Tracey|Ting Wang|Sarah M. Glass|Chuck Locuson|Upendra P. Dahal|Licong Jiang|Dustin M. Smith|Robert L. Walsky|Felix Huth|Birk Poller|Kenichi Umehara|Lawrence Cohen|Niresh Hariparsad
药物动力学、动态与代谢部，辉瑞公司，格罗顿，康涅狄格州，美国