ADARs通过HNF1α调控肝脏UGT1A6表达

《Drug Metabolism and Pharmacokinetics》：ADARs regulate hepatic UGT1A6 expression via HNF1α

　　摘要A-to-I RNA编辑，由作用于RNA的腺苷脱氨酶1（ADAR1）或ADAR2催化，是人类中最普遍的RNA修饰，在转录后调控中发挥关键作用。虽然我们最近的研究已证明ADAR在肝脏细胞色素P450调控中的作用，但其对其他药物代谢酶的影响仍不清楚。本研究考察了A-to-I RNA编辑是否调控UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）1A。敲低ADAR显著降低了HepaRG和Huh-7细胞中UGT1A6 mRNA水平，以及UGT1A6蛋白水平及其活性。荧光素酶实验显示，包含肝细胞核因子1α（HNF1α）结合位点的UGT1A6启动子区域参与了ADAR敲低后UGT1A6表达的下降。此外，ADAR敲低降低了HNF1α mRNA和蛋白水平，提示HNF1α下调是UGT1A6表达减少的主要驱动因素。机制上，使用含有HNF1α 3'-UTR及其突变体的报告质粒进行的荧光素酶实验表明，ADAR敲低导致的HNF1α下调是由miR-15b表达改变或与HNF1α 3'-UTR结合改变引起的。本研究揭示了一种新的调控机制，即ADAR通过miR-15b调节上调HNF1α从而增强UGT1A6表达，拓宽了对药物代谢中转录后调控的理解。引言药物代谢存在显著的个体间差异，这导致药物疗效和不良反应风险的个体差异[1]，[2]。理解调控药物代谢酶表达的机制对于推进高效药物开发和个体化或精准医学至关重要。在哺乳动物中，基因表达在多个水平上受到调控，包括转录、转录后、翻译和翻译后过程。腺苷到肌苷（A-to-I）RNA编辑将双链RNA结构中的腺苷转变为肌苷，是影响转录后调控的最常见RNA修饰形式[3]。这种修饰由作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）催化，可以改变氨基酸序列、RNA剪接、微小RNA（miRNA）靶向和miRNA成熟[4]。人类ADAR家族包含三个成员：ADAR1、ADAR2和ADAR3[5]。ADAR1存在两种亚型，ADAR1 p110和ADAR1 p150，它们在转录起始位点和起始密码子上有所不同。ADAR1 p110主要定位于细胞核，而ADAR1 p150同时存在于细胞核和细胞质中[6]，[7]。ADAR1和ADAR2在全身广泛表达且具有酶活性，而ADAR3是脑特异性的且缺乏编辑活性[8]，[9]。ADAR1和ADAR2具有不同的底物偏好。ADAR1优先编辑长的、近乎完美的双链体，例如由反向Alu重复序列形成的双链体，而ADAR2则以更为位点选择性的方式作用于相对较短的不完美双链体[10]。最近的转录组全分析也显示两者的编辑位点重叠有限，进一步支持这两种酶具有不同的靶标偏好[11]。我们之前的研究显示，32个人类肝脏样本中ADAR1表达存在显著的个体间差异[12]。此外，我们证明A-to-I RNA编辑调控药物代谢细胞色素P450（P450）的表达，如CYP2B6和CYP2C8（Nozaki等，2019），以及人类肝脏中的关键转录因子，包括孕烷X受体[13]和组成型雄甾烷受体[14]。UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）构成了一个主要的药物代谢酶家族，仅次于P450[15]。这些酶催化广泛的内源性和外源性化合物的葡萄糖醛酸化[16]。19种人类UGT亚型分为三个亚家族：UGT1A、UGT2A和UGT2B[17]。其中，UGT1A家族在药物代谢中发挥特别重要的作用[15]。UGT1A亚型通过亚型特异性的第一外显子与共同的外显子2-5的交替剪接产生[18]。在肝脏（葡萄糖醛酸化的主要部位）中，UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6和UGT1A9显著表达[19]，[20]。我们课题组此前证明了这些UGT1A mRNA表达水平存在巨大的个体间差异（74-1,443倍）[19]。同样，Achour等[21]在23个人类肝脏样本中报道了这些UGT1A亚型蛋白水平有7至18倍的变化。REDIportal是一个开放获取数据库，提供从公开RNA测序数据中鉴定出的A-to-I RNA编辑位点的全面目录，表明UGT1A mRNA经历A-to-I RNA编辑。然而，这种RNA编辑对UGT1A表达的影响仍不清楚。本研究旨在确定A-to-I RNA编辑是否作为肝脏中UGT1A表达的调控机制，并阐明潜在的分子机制。章节片段化学试剂和材料阿拉甲素、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）和放线菌素D购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。血清素购自FUJIFILM Wako Pure Chemical（Osaka, Japan）。Lipofectamine RNAiMAX、针对人ADAR1（s1007）（siADAR1）、人ADAR2（s1010）（siADAR2）的Silencer Select小干扰RNA以及阴性对照#1（siControl）购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA）。pGL3-promoter载体、pNL1.1载体和Nano-Glo双荧光素酶报告ADAR敲低对UGT1A表达和UGT1A6活性的影响为研究ADAR1和ADAR2是否影响UGT1A亚型的表达，将siADAR1和siADAR2转染到HepaRG细胞中。如图1A所示，siADAR1和siADAR2转染分别有效降低了ADAR1和ADAR2蛋白水平。敲低ADAR1和ADAR2显著降低了UGT1A1（图1B）和UGT1A6（图1E）mRNA水平，但对UGT1A3（图1C）、UGT1A4（图1D）和UGT1A9（图1F）mRNA水平没有影响。为证实UGT1A1和讨论ADAR具有通过催化腺苷向肌苷的转化来调控基因表达和功能的潜力。虽然RNA编辑对P450的影响已被阐明[26]，但其对在II相药物代谢中起关键作用的UGT的影响仍不清楚。REDIportal是一个开放获取数据库，提供A-to-I RNA编辑位点的全面目录，表明UGT1A mRNA经历A-to-I RNA编辑。在本研究中，我们考察了ADAR是否调控结论我们的研究表明，A-to-I RNA编辑酶显著影响UGT1A的表达，特别是UGT1A6，其受mRNA稳定性变化和HNF1α介导的转录调控的影响。鉴于先前发现人类肝脏中ADAR1蛋白水平有220倍的个体间差异[12]，我们的结果凸显了ADAR作为导致UGT1A表达个体间差异及随之而来的药物代谢差异的新调控层。CRediT作者贡献声明Shuji Takeuchi：撰写-初稿，调查，数据管理。Tatsuki Fukami：监督，概念化。Masataka Nakano：撰写-审阅与编辑，监督，方法学，概念化。Miki Nakajima：撰写-审阅与编辑，监督，项目管理。利益冲突声明无资助本工作由日本学术振兴会科学研究费补助金（B）（24K02192）、武田科学振兴基金会和日本文部科学省世界顶尖国际研究中心计划（WPI）资助。