嵌合抗原受体T细胞治疗on-target/off-disease与off-target/off-disease风险的体外评价关键考量

《Cytotherapy》：Key Considerations for In Vitro Assessment of On- and Off-target/ Off-Disease Effects of Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapies

　　

工程化靶向免疫细胞疗法（如嵌合抗原受体（CAR）T细胞）的临床成功受到以下风险制约：靶向/非疾病组织（on-target/off-disease）靶向以及脱靶/非疾病组织（off-target/off-disease）毒性，即T细胞攻击健康组织。由于物种特异性差异限制动物模型的效用，非临床安全性评估具有挑战性。该文在现有监管指南框架下，全面概述用于评估这些风险的计算机模拟（in silico）和体外（in vitro）策略。评估从严格的靶点选择开始，强调利用生物信息学、免疫组织化学（IHC）和流式细胞术对健康和疾病人组织进行全面的靶点表达分析的重要性。为评估结合特异性，基于IHC的组织交叉反应（TCR）研究和基于细胞的蛋白质阵列对于识别潜在脱靶相互作用至关重要。最后，功能评估最为重要，重点在于使用原代人细胞或代表重要器官的先进模型进行体外共培养试验。关键读数包括细胞毒性（预测组织损伤的主要终点）、细胞因子分泌和T细胞活化标志物。该文还讨论了试验设计、细胞组选择和数据解读的考虑因素，包括确认和情境化筛选试验阳性命中结果的策略。这些原则被扩展至双靶向CAR和T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）等额外模式，突出其安全性评估的独特考虑。这些原则进一步通过案例研究展示，说明如何应用不同的体外和体内方法处理特定CAR T细胞疗法的on-/off-target off-disease风险。总体而言，该工作综合了一个适用于目标用途的、迭代式的靶向免疫细胞疗法非临床安全性分析框架。

研究背景与问题：工程化靶向免疫细胞疗法，尤其嵌合抗原受体（CAR）T细胞，已用于难治性肿瘤及自身免疫等疾病。其关键安全性问题是靶向/非疾病组织效应（on-target/off-disease，即目标抗原在健康组织表达导致毒性）和脱靶/非疾病组织效应（off-target/off-disease，即攻击健康组织上的无关抗原）。由于结合物跨物种反应性、靶点表达谱和生物学保守性差异，以及宿主抗移植物反应导致快速清除，标准动物安全性试验不适用。美国食品药品监督管理局（FDA）2024年CAR T细胞非临床考虑指南仍要求个案化策略，2026年新方法指南提供验证框架，2013年细胞和基因治疗临床前评估指南亦相关。因此，该文在监管框架下综述计算机模拟（in silico）和体外（in vitro）策略，提出基于风险、迭代的非临床安全评估框架。研究内容、结论与意义：该文整合靶点选择、结合特异性、功能试验及风险随访，强调结合数据须由功能试验确认，并以细胞毒性为主要终点，支持更安全CAR T细胞产品的开发与监管决策。

关键技术方法（不超过250字）：采用生物信息学/计算机模拟检索健康与疾病组织靶点表达，并以免疫组织化学（IHC）、原位杂交（ISH）和流式细胞术验证；以基于IHC的组织交叉反应（TCR）研究、基于细胞的蛋白质阵列（CBPA）和重组蛋白阵列评估结合特异性；以原代或诱导多能干细胞（iPSC）来源细胞、重要器官细胞及表达潜在脱靶蛋白的细胞进行体外共培养，检测细胞毒性、细胞因子分泌和T细胞活化标志物；并评估强直信号（tonic signaling）、双靶向CAR逻辑门控及T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）的肽/人类白细胞抗原（HLA）交叉反应。样本来源包括人体正常组织微阵列、患者肿瘤样本、健康供者原代细胞或iPSC来源细胞、CD34⁺造血祖细胞及HLA分型供者细胞；部分案例涉及猴/鼠组织和异种移植模型。

研究结果：
靶点选择（Target Selection）：理想靶点应在肿瘤/病变细胞高且均匀表达、健康组织完全缺失；新抗原理想但少见，故需评估正常组织有限表达靶点的风险。临床案例提示即使正常组织低表达也可出现on-target/off-disease毒性，需按适应证权衡风险/获益并考虑炎症等条件下靶点上调。
靶点选择的计算方法（Computational Methods for Target Selection）：通过生物信息学/计算机模拟检索健康与疾病组织基因/蛋白表达数据资源，并辅以文献复习获取表达谱。
靶点选择的实验方法（Experimental Methods for Target Selection）：以ISH、IHC、流式细胞术检测健康与疾病组织样本中靶点表达与分布，需验证检测试剂特异性/敏感性并用阳性/阴性细胞和组织对照；健康组织获取和质量控制是限制。
on-/off-target结合评估（On-/ Off-Target Binding Assessments）：强调早期评估，注意CAR工程化可能改变单链可变片段（scFv）/重链可变域（VHH）/结合域特异性，甚至互补决定区（CDR）外氨基酸也影响特异性；主要方法包括IHC-TCR、CBPA和重组蛋白阵列。
基于IHC的组织交叉反应研究（IHC-based Tissue Cross-reactivity Studies）：用候选抗体或CAR靶向部分（如scFv/VHH与片段结晶区（Fc）尾融合）免疫标记正常成人组织冷冻切片，观察组织/细胞/亚细胞定位、强度和频率；优势是组织学背景和天然蛋白修饰，局限是并非所有结合物适合IHC、不能确定结合蛋白身份、组织处理可改变表位。对CAR T细胞，商业抗靶点抗体不能替代IHC-TCR；膜/细胞外结合比胞质/核结合更受关注。
基于细胞的蛋白质阵列（Cell-based Protein Arrays, CBPA）：通过表达全长人蛋白的细胞微阵列筛查整个CAR T细胞或结合物，并用非转导（NTD）对照区分CAR依赖与非依赖结合；可确认已知靶点、发现脱靶并筛查最终构建体，但缺乏组织背景、可能遗漏四级结构/剪接变体/翻译后修饰，过表达支持危害识别而非风险评估。命中需用流式细胞术验证亲和力并用生物信息学评估组织表达，再进入功能共培养。
重组蛋白阵列（Recombinant Protein Arrays）：可评估结合物与固定重组蛋白/片段的结合，但仅能评估靶向部分，蛋白常不完整且缺乏细胞/组织背景，故通常不用于CAR T细胞on-/off-target结合评估。
体外/功能试验（In vitro/ Functional Assays）：共培养试验用健康供者原代或iPSC来源细胞，按一个或多个效靶比（E:T）共培养数小时至数天，检测活化、细胞因子释放和细胞毒性；需设靶点阳性/阴性细胞、NTD/模拟转导T细胞、单培养和培养基对照，并用毒性诱导化合物或阳性对照CAR验证读数；建议多供者但受可行性限制。
细胞组选择（Selection of Cell Panels）：目标细胞分四类：预期靶点表达组织细胞、重要毒性器官细胞、结合研究提示的潜在脱靶蛋白表达细胞、与CAR靶点同源的蛋白表达细胞；优先纳入重要器官，并考虑组织异质性和选择适当细胞类型。
体外/功能试验读数（In Vitro Assay/ Functional Assay Readouts）：比较正常细胞与疾病细胞的细胞毒性/细胞因子剂量反应可推导相对安全边际。
细胞毒性（Cytotoxicity）：可用乳酸脱氢酶（LDH）等无标记法、放射性/荧光/外源蛋白标记、流式或成像/阻抗法；需考虑终点与实时、贴壁与悬浮细胞、标记对细胞活力和效应功能的影响。
细胞因子分泌（Cytokine Secretion）：干扰素-γ（IFNγ）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、IL-2等是关键活化指标，IFNγ已用于获批CAR-T效价试验；可检测更广的细胞因子/趋化因子谱。
T细胞活化标志物（T-Cell Activation Markers）：FDA指南将细胞毒性和细胞因子产生列为潜在读数；细胞因子读数通量高且可回收细胞做表型分析，但细胞毒性是预测组织破坏的最相关读数，应优先；若以细胞因子/活化标志物为主要读数，阳性结果宜用细胞毒性试验随访。
体外功能试验的随访（Follow-up from in vitro Functional Assays）：需多E:T比、多供者重复；结合靶点表达数据区分on-target/off-disease与off-target/off-disease，并用阻断试验确认靶点特异性；多正交读数提高稳健性；细胞毒性幅度应与有效杀瘤治疗窗相对比较，无预设阈值。
超越靶点结合与信号的其他考虑（Other Considerations Beyond Target Binding and Signaling）：包括建立预测体内不良效应的最低细胞毒性水平、评估强直信号、双靶向CAR构建体和TCR-T产品。
建立预测体内不良效应的最低细胞毒性水平（Establishing Minimum Levels of Cytotoxicity for Prediction of Adverse Effect in vivo）：高GM-CSF、IL-6、IL-1β、C反应蛋白（CRP）、IFNγ、TNFα、IL-2与更强组织损伤/全身毒性相关；亲和力/亲合力微调可使CAR T细胞区分肿瘤高抗原与健康细胞生理水平；监管机构尚未定义明确阈值，需标准化对照和绝对值/倍数变化报告。
评估强直信号（Assessing Tonic Signaling）：强直信号是T细胞持续低水平活化，可增强敏感性但也可致过度活化、脱靶细胞毒性、细胞因子释放综合征（CRS）和耗竭；可用有/无靶细胞或刺激细胞因子的共培养检测CD69、CD25、IFNγ、IL-2，流式/免疫分析及CD3ζ、ERK、AKT磷酸化，亦可用无细胞因子生长试验并以NTD和IL-2/IL-7对照。
评估双靶向CAR构建体（Assessing Dual-Targeting CAR Constructs）：双靶向可结合嵌合共刺激受体（CCR）和逻辑门控（OR、AND、NOT、IF-BETTER）提高特异性；需了解两靶点正常组织表达及重叠模式，分别或联合表征结合特异性，并用表达不同抗原组合/水平的正常细胞或工程细胞系做功能试验。
T细胞受体工程化T细胞产品（TCR-T Products）：TCR-T识别HLA提呈的肽，可靶向胞内蛋白但限制患者HLA型；需用正确HLA型健康细胞评估，注意肽非依赖HLA同种异体反应和肽特异交叉反应；可用HLA多样淋巴母细胞系、丙氨酸/X扫描、组合肽库、蛋白组数据库筛选及肽滴定和原代细胞刺激确认；尚无稳健体内模型，人源体外模型最佳。
案例研究（Case Studies）：通过具体CAR T疗法说明如何用体外/体内方法处理on-/off-target off-disease风险。
评估on-target/off-disease风险（Assessment of On-target/ Off-Disease Liability）：例1 CLDN18.2 CAR T：人组织微阵列显示正常组织仅胃表达，小鼠替代CAR在有效剂量未见明显胃病理，I期试验显示胃黏膜损伤8.2%、≥3级呕吐3.1%，无剂量限制性毒性（DLT），总体安全可控；例2靶点X：正常肾小管上皮有较低表达，原代肾上皮与CAR T共培养出现IFNγ但显著低于肿瘤细胞且与表达水平相关，提示安全边际。
评估off-target/off-disease风险（Assessment of Off-Target/ Off-Disease Liability）：例3肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）嵌合自身抗体受体（CAAR）T：膜蛋白组阵列提示基质金属蛋白酶16（MMP16）、低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）潜在脱靶，但MMP16/LRP4表达细胞及7类原代/iPSC来源细胞共培养未见细胞毒性或IFNγ分泌；例4 CLDN18.2同种异体CAR T：CBPA提示GPRC5D结合，CLDN18.1因序列相似为潜在脱靶，但表达GPRC5D或CLDN18.1的HEK293T共培养未见细胞毒性；小鼠高剂量可见胃和肺毒性，较低抗肿瘤剂量不明显，支持治疗窗；例5 CD123 CAR T：CD123在造血干/祖细胞（HSPC）和内皮细胞表达带来on-target/off-tumor风险，不同载体结构、scFv/VHH设计和亲和力影响毒性，体外CD34⁺祖细胞共培养和集落形成试验显示部分产品抑制造血，降低E:T比或采用可切换/安全开关CAR可减轻；早期UCART123试验出现严重血管毒性，而可切换UniCAR和安全开关CAR试验未见DLT或骨髓发育不良/内皮损伤证据。

讨论与结论部分总结：该文强调无单一试验可完全定义CAR T安全性，需采用分层策略整合结合与功能数据；IHC-TCR提供组织学背景，CBPA可识别潜在相互作用，但结合不等于生物学后果；原代/iPSC来源人细胞共培养对判断活化、细胞因子释放和细胞毒性至关重要，并应优先细胞毒性终点。若健康组织确认显著结合或活化，最快补救是更换克隆或构建体；否则可修饰scFv或采用不同CAR配置/双靶向逻辑门控。强直信号及TCR-T肽/HLA交叉反应需专门体外试验和序列评估。整体应在表达谱、结合、功能效应和生物学合理性基础上进行机制感知的风险获益评价。结论部分翻译：最终，安全有效的工程化T细胞疗法开发取决于多样化、人源相关工具的审慎应用。通过整合表达谱分析、结合表征和功能试验，并在每个靶点的生物学和临床背景中解读这些结果，研发人员可以更好地预判潜在风险、优化治疗设计并支持监管决策。随着该领域发展，持续完善这些方法对于引导下一代疗法在最大化疗效的同时最小化伤害至关重要。