基于脑脂质组学指导的辅助脂质筛选增强颅内mRNA递送效率

《Cell Biomaterials》：Brain-informed helper lipid selection enhances intracranial mRNA delivery

　　

摘要专业翻译 基因治疗有望调节或纠正神经发育、精神及神经疾病中的病理性神经活动。然而，目前的基因递送方法主要依赖腺相关病毒（AAV），其存在载货容量受限、预先存在及治疗诱导的免疫应答以及生产工艺复杂等局限。此外，某些转基因（如CRISPR-Cas9核酸酶）的持续表达可引起细胞毒性和脱靶效应。因此，缺乏安全、瞬时且可重复给药的非病毒递送系统仍是脑定向疗法的主要瓶颈。 脂质纳米颗粒（LNP）在核酸递送方面具有多项优势：可包封大且多样的载荷、可规模化工业生产、可实现瞬时基因表达（从而降低长期毒性风险），且通常诱发较低的免疫应答从而支持重复给药。然而，大多数优化工作集中于可电离脂质的发现和系统生物分布，LNP常在吞噬细胞（如巨噬细胞）中蓄积，对脑实质的穿透能力有限。近年来，表面工程、可电离脂质化学及肽介导靶向的进展已初步实现LNP经系统给药穿越血脑屏障，为需要全脑递送的疾病拓展了机遇。相比之下，许多中枢神经系统（CNS）疾病具有解剖学限定性，如海马局灶性癫痫或帕金森病中黑质纹状体多巴胺能神经元的退变，此类疾病的治疗获益于将暴露限制在受累区域。因此，颅内给药已被用于多种细胞和病毒基因治疗，并已常规应用于啮齿类神经科学实验以引入基因编码的效应器和报告分子。然而，LNP的直接颅内递送仍 largely 未被探索，提升其疗效有望同时推动新型神经科学工具和治疗应用的发展。 脂质是脑内最丰富的生物分子类别之一，在不同亚细胞区室（如突触囊泡和髓鞘）、细胞类型及脑区中形成组成各异的膜环境。不同脑微环境中富集的脂质类别可调节膜有序度、曲率倾向和结构域组织。由于LNP本身即脂质组装体，以脑富集脂质配制LNP可类似地调节颗粒结构、膜结合和内体逃逸。辅助脂质直接参与这些相互作用及LNP递送过程，但仍是LNP组分中研究最少的成分之一。可电离脂质已通过数百至数千种结构的文库得到优化，胆固醇也已被系统性替换为天然及合成类似物，然而大多数LNP配方仍依赖辅助脂质1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）。脑脂质种类远为多样，且整个脂质类别在此角色中仍未得到充分探索，包括鞘脂类（如鞘磷脂和半乳糖基神经酰胺）以及具有多不饱和酰基链的磷脂。 在此，研究人员提出假设：以脑脂质组学信息指导辅助脂质选择，可配制出在颅内信使RNA（mRNA）递送方面优于传统LNP的配方。利用空间和整体脂质组学资源作为选择指南和候选结构来源，研究人员组装了一个包含22种辅助脂质的筛选面板，涵盖具有不同头基、酰基链长度、不饱和度及不对称性的磷脂和鞘脂。该筛选鉴定出N-神经酰基鞘磷脂（nSM）——一种富集于白质和脑室的长链不对称鞘磷脂——作为辅助脂质，在测试的大多数神经及非神经细胞类型和可电离脂质骨架组合中均提高了转染效率。nSM显著提高了细胞摄取并降低了内体共定位，而结构表征和机制实验揭示了多层状及泡状超微结构特征，并在内体样条件下增强了膜融合性，这些特性与增强的递送效率一致。在体内测试中，nSM LNP提高了小鼠脑内颅内CRISPR编辑效率，并实现了清醒小鼠行为的可光遗传学控制。在人体系统中，nSM LNP在诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元中的mRNA递送方面优于基准配方，并实现了离体脑组织的功能性转染。该研究结果确立了脑脂质组学指导的脂质选择作为工程化LNP特性以改善脑内基因递送的策略，并将nSM纳入长期局限于少数经典选项的辅助脂质库中。

论文解读

一、研究背景与科学问题

基因治疗为神经发育、精神及神经退行性疾病提供了调控或纠正病理性神经活动的潜力。然而，当前基因递送的主流载体腺相关病毒（AAV）存在载货容量受限、免疫原性及生产工艺复杂等固有局限。此外，CRISPR-Cas9等转基因的持续表达可能引发细胞毒性和脱靶效应。因此，开发安全、瞬时、可重复给药的脑内非病毒递送系统是神经治疗领域的重大瓶颈。

脂质纳米颗粒（LNP）因其可包封大分子核酸载荷、可规模化生产、支持瞬时表达和重复给药等优势，成为极具前景的核酸递送平台。然而，既往LNP优化工作集中于可电离脂质的发现与系统给药后的生物分布，直接颅内递送LNP的研究相对匮乏。辅助脂质作为LNP的核心组分之一，直接参与颗粒结构、膜结合及内体逃逸等关键递送环节，但长期以来仅局限于DSPC和DOPE等少数经典选项，其多样性远未得到开发。脑组织富含种类多样的脂质，不同脑区和亚细胞结构具有特征性脂质组成，这为基于脑脂质组学指导辅助脂质筛选提供了天然的生物学依据。研究人员由此提出假设：以脑脂质组学信息指导辅助脂质选择，可开发出在颅内mRNA递送方面优于传统配方的LNP制剂。

二、研究内容与主要结论

研究人员以空间和整体脂质组学数据为选择指南，组装了涵盖22种脑富集脂质的筛选面板，系统评估了不同辅助脂质在多种神经及非神经细胞类型中的mRNA递送效率。筛选结果鉴定出N-神经酰基鞘磷脂（nSM）——一种富集于白质和脑室的长链不对称鞘磷脂——作为高效辅助脂质，可将转染效率提高2至10倍，且该增强效应在不同可电离脂质骨架、不同mRNA载荷及多种细胞类型中均得到验证。机制研究表明，nSM LNP通过胆固醇依赖性途径增强细胞摄取，降低内体共定位，并在酸性内体条件下从有序膜结构转变为融合性六方相（H_II）结构，从而促进内体逃逸和胞质mRNA递送。在体内实验中，nSM LNP显著提高了小鼠脑内CRISPR-Cas9介导的基因编辑效率，实现了内源性神经元基因的敲除，并成功驱动光遗传学致动器表达以实现清醒小鼠行为的可逆光控。在人体系统中，nSM LNP在iPSC来源神经元中实现了高效基因编辑，并在离体人脑组织中实现了功能性转染。

三、主要关键技术方法

本研究采用的核心技术方法包括：基于脑脂质组学数据的辅助脂质理性筛选策略，涵盖22种候选脂质的体外荧光素酶报告基因转染筛选；LNP理化性质表征，包括动态光散射（DLS）粒径与ζ电位分析、RiboGreen RNA包封率测定、冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）超微结构观察、Laurdan广义极化（GP）膜有序度测量及基于荧光共振能量转移（FRET）的脂质混合融合性检测；细胞摄取与内体逃逸评估，包括流式细胞术定量、内吞抑制剂药理学干预及共聚焦显微镜共定位分析；体内基因编辑评价采用Ai9报告小鼠和野生型C57BL/6J小鼠的立体定位颅内注射，通过tdTomato报告基因表达和NeuN免疫组化定量编辑效率；光遗传学行为实验采用Ai32小鼠结合光纤植入和473 nm蓝光刺激；人体验证体系包括iPSC来源神经元分化转染及离体人胎儿脑组织切片培养转染。人胎儿脑组织样本来源于妊娠16至24周的知情同意捐献者。

四、研究结果

脑脂质组学指导的辅助脂质筛选鉴定nSM为增强LNP介导mRNA递送至神经元和胶质细胞的高效辅助脂质

研究人员以SM-102为可电离脂质，将经典辅助脂质DSPC替换为21种候选脑富集脂质，在终末分化N2A神经元、原代人星形胶质细胞和HMC3小胶质细胞中通过荧光素酶报告基因检测评估转染效率。结果表明，鞘磷脂类为表现最优的脂质类别，其中不对称长链鞘磷脂nSM（SM (d18:1/24:1(15Z))）提升效果最为显著，转染效率较DSPC配方提高2至10倍。该增强效应在MC3、ALC-0315、cKK-E12和DODMA等多种可电离脂质骨架中均得到验证，并扩展至GFP mRNA载荷及非神经细胞类型，表明nSM具有配方通用性而非特异性效应。nSM与DSPC配方在水动力学直径、ζ电位、包封效率和颗粒浓度方面无显著差异，排除了理化性质差异对递送改善的贡献。

nSM LNP通过胆固醇依赖性摄取促进胞质mRNA递送

为阐明nSM增强功能性递送的机制，研究人员使用Cy5标记GFP mRNA结合流式细胞术和共聚焦显微镜表征细胞摄取与转运。结果显示，nSM LNP使N2A神经元内Cy5-mRNA积累较DSPC LNP提高近10倍，且Cy5阳性细胞比例相似但单细胞表达水平更高。内吞抑制剂实验表明，nSM LNP的摄取对胆固醇提取剂甲基-β-环糊精（MβCD）和脂筏/小凹依赖性内吞抑制剂金雀异黄酮（genistein）更为敏感，提示其通过胆固醇依赖性途径内化。共定位分析显示nSM LNP递送的mRNA与溶酶体标志物的共定位显著降低，表明内体逃逸效率提高。

理化表征揭示nSM LNP呈现多层状结构、增强的膜有序度及融合性

冷冻透射电镜（cryo-TEM）观察显示，DSPC LNP以泡状和单层囊泡结构为主，而nSM LNP更频繁呈现多层状形态。Laurdan广义极化（GP）光谱显示nSM LNP在生理pH（7.4）下具有更高的膜有序度，而在内体样酸性条件（pH 5.5）下GP值降低，表明酸触发膜流动性增加。基于荧光共振能量转移（FRET）的脂质混合实验表明，nSM LNP在pH 5.5下诱导更强的膜混合，提示融合性增强。快速傅里叶变换（FFT）分析进一步揭示nSM LNP在低pH下更易形成六方相（H_II）结构，该结构已被认为与增强的融合性和内体逃逸相关。

nSM LNP改善小鼠脑内CRISPR-Cas9编辑效率

研究人员将共包封Cas9 mRNA和靶向loxP-STOP-loxP序列的sgRNA的nSM LNP注射至Ai9报告小鼠海马，以tdTomato表达评估编辑效率。与基于FDA批准的Onpattro配方（MC3/DSPC）相比，nSM LNP将编辑效率从4.8%±0.9%提高至16.0%±1.7%，提升3.3倍。编辑组织的空间分布面积和体积相当，但nSM LNP产生显著更高的编辑细胞比例。在纹状体注射中也观察到类似增强效应。细胞类型分析显示，nSM LNP将编辑细胞中NeuN阳性神经元的比例从21%±4%提高至69%±12%，且神经元编辑比例从2.0%±0.9%提高至9.7%±1.9%，而星形胶质细胞和小胶质细胞编辑无显著差异。胶质反应评估显示，nSM LNP注射后2周的胶质反应已恢复至对侧基线水平，而MC3 LNP仍存在持续的胶质激活。

nSM LNP实现内源性神经元基因的体内编辑

研究人员使用靶向Rbfox3（NeuN）的sgRNA，将nSM LNP注射至野生型小鼠海马齿状回。体外验证显示该sgRNA在N2A细胞中实现89.3%±0.2%的插入缺失（indel）效率。以非靶向（NT）sgRNA作为同侧对照，nSM LNP在注射后6周将NeuN阳性细胞比例降低33.7%±5.8%，而基准MC3配方仅降低17.3%±2.8%。编辑效应具有空间局限性，邻近CA1亚区的NeuN阳性比例未受影响。值得注意的是，体外靶向测序在预测脱靶位点检测到一定水平的编辑，提示治疗应用需进一步优化sgRNA特异性。

nSM LNP支持光遗传学控制小鼠行为

研究人员将编码Cre重组酶的mRNA包封于nSM LNP中，注射至Ai32小鼠次级运动皮层（M2），该小鼠携带Cre依赖性ChR2(H134R)-EYFP等位基因。注射后2周，ChR2-EYFP表达局限于靶向M2区域。在473 nm蓝光（20 Hz、5 ms脉冲）刺激下，Cre注射动物运动速度从基线28.9±2.4 mm/s提高至61.7±6.4 mm/s，对侧转向偏好在刺激期间从21.5%±6.5%上升至78.4%±3.1%，刺激停止后恢复至基线水平。GFP注射对照动物无相应变化，且该反应在连续3天的测试中均可靠诱发。

nSM LNP增强人神经元mRNA递送并转染离体脑组织

在iPSC来源神经元中，nSM LNP驱动的GFP表达显著优于MC3 LNP。研究人员进一步递送Cas9 mRNA与靶向RBFOX3的sgRNA，nSM LNP在靶位点实现72.3%±0.2%的indel频率，主要indel类型为预测导致功能敲除的移码突变。在离体人胎儿脑组织切片中，nSM LNP经显微注射实现GFP功能性表达，转染效率较MC3 LNP呈现提高趋势。

五、讨论与结论

本研究建立了组织脂质组学指导的辅助脂质选择策略，鉴定出鞘磷脂类为高效的辅助脂质类别，其中nSM通过促进多层状结构形成、增强膜有序度及酸性条件下向融合性H_II相的快速转变，实现了胞质mRNA递送的近10倍提升。体内实验证实nSM LNP在CRISPR编辑效率和神经元靶向性方面均优于基准配方，且不伴随持久的胶质反应。光遗传学实验证明nSM LNP可递送足以驱动功能性神经调控的mRNA载荷。人体iPSC神经元和离体脑组织实验为临床转化提供了概念验证。研究结论指出，在可电离脂质优化之外，扩展辅助脂质库可达到与优化可电离脂质相当的递送效率提升，该策略为神经系统非病毒基因治疗的发展提供了新的设计框架。研究局限性包括：编辑持久性需更长时间观察验证；Rbfox3 sgRNA的脱靶活性提示治疗应用需严格评估guide特异性；离体脑组织样本量有限；人体系统结果不能直接预测成人中枢神经系统中的递送效率。未来研究可探索其他组织脂质组学是否同样能指导高效辅助脂质的筛选。