《Cellular Signalling》：Mechanistic study on the promotion of osteogenic differentiation in osteoporotic rats by moxibustion via regulation of BMSCs-derived exosomal miR-27a-3p–mediated mitophagy
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摘要目的探讨艾灸对去卵巢（OVX）大鼠骨质流失和成骨分化的影响，并确定这些效应是否通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的外泌体miR-27a-3p介导线粒体自噬来实现。方法本研究分三个阶段进行。第一阶段，对假手术（SO）、去卵巢（OVX）和去卵巢+艾灸（OVX+MOX）大鼠进行
摘要
目的
探讨艾灸对去卵巢（OVX）大鼠骨质流失和成骨分化的影响，并确定这些效应是否通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的外泌体miR-27a-3p介导线粒体自噬来实现。
方法
本研究分三个阶段进行。第一阶段，对假手术（SO）、去卵巢（OVX）和去卵巢+艾灸（OVX+MOX）大鼠进行微计算机断层扫描（micro-CT）以评估骨量，并采用茜素红S（ARS）染色评估成骨分化。同时检测自噬相关标志物，并通过免疫荧光评估线粒体-溶酶体共定位。第二阶段，向OVX+MOX大鼠给予线粒体自噬抑制剂Mdivi-1，以确定线粒体自噬对艾灸效应的贡献。测序分析和TargetScan预测确定了miR-27a-3p与线粒体自噬相关基因PINK1之间的潜在调控关系，随后通过双荧光素酶报告基因实验进行验证。第三阶段，使用miR-27a-3p agomir和antagomir研究miR-27a-3p-线粒体自噬轴的参与作用。
结果
艾灸增加了OVX大鼠的骨密度，改善了骨微结构，增强了成骨分化，并伴随线粒体自噬的增加。Mdivi-1减弱了这些有益效应，加剧了骨质流失，并降低了成骨基因表达、矿化结节形成、线粒体膜电位和线粒体自噬。双荧光素酶报告基因实验证实PINK1是miR-27a-3p的直接靶点。使用antagomir抑制miR-27a-3p会损害骨微结构、线粒体自噬和成骨作用。相反，艾灸产生的效应与miR-27a-3p agomir相当，两种干预均通过miR-27a-3p-线粒体自噬轴促进成骨分化。
结论
艾灸通过促进成骨分化减轻OVX诱导的骨质疏松症（OP）骨质流失。这些效应可能至少部分通过BMSCs相关的miR-27a-3p/PINK1轴激活线粒体自噬来介导，为艾灸治疗OP的疗效提供了潜在的机制基础。
引言
骨质疏松症（OP）是一种系统性代谢性骨病，以骨量减少、骨密度降低、骨微结构退化和骨骼脆性增加为特征，共同导致骨折风险显著升高[1]。流行病学研究估计全球OP患病率约为18.3%，女性高于男性[2]。骨质疏松性脆性骨折是老年人残疾和死亡的主要原因。全球范围内，预计约三分之一的女性和五分之一的50岁以上男性将经历由OP引起的脆性骨折[3]，[4]。髋部骨折尤为严重，骨折后第一年内的死亡率约为20%。2005年至2025年间，美国与脆性骨折相关的经济负担大幅增加，其中髋部骨折约占总费用的72%[5]，[6]。目前OP的药物治疗主要依赖抗骨吸收剂和促骨形成剂。然而，长期治疗可能伴随不良反应，限制了部分患者的长期使用[7]。艾灸（MOX）作为一种传统中医干预手段，在OP中也显示出有益效果[8]，[9]。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其成骨分化能力，作为OP的潜在治疗靶点受到广泛关注[10]，[11]，[12]。然而，线粒体功能障碍会削弱BMSCs的成骨潜能，还可能损害增殖、诱导凋亡或促进细胞周期阻滞[13]。线粒体自噬是一种选择性线粒体质量控制机制，可清除受损或多余的线粒体，从而维持线粒体稳态和功能完整性。因此，BMSCs的存活和成骨能力与线粒体稳态密切相关[14]。越来越多的证据表明，激活线粒体自噬可增强成骨分化，并可能有助于预防或治疗OP[15]，[16]，[17]。与此同时，BMSCs的旁分泌活性，特别是由外泌体及其微小RNA（miRNA）货物介导的旁分泌活性，已成为骨再生中的重要机制。据报道，BMSCs来源的外泌体通过激活线粒体自噬和增加线粒体自噬相关蛋白的表达来增强成骨分化[18]。这种效应可能至少部分由BMSCs来源外泌体内转运的miRNA介导[19]。
miRNA是内源性非编码单链RNA，通常长20-24个核苷酸，在转录后水平调节基因表达。通过与靶mRNA的3'非翻译区（3'UTRs）中的互补序列结合，miRNA可抑制翻译或促进mRNA降解，从而调节多种生物学过程，包括增殖、分化、凋亡和代谢[20]。多项研究表明，多种miRNA可调节参与成骨细胞分化的分子靶点，从而在OP实验模型中调控成骨作用[21]。在我们之前对艾灸治疗的骨质疏松大鼠进行的miRNA测序分析中，OVX后失调的多个miRNA在艾灸治疗后得到逆转[22]。其中，miR-23b-3p已被报道通过调节信号通路改善绝经后OP[23]，而miR-452-3p通过靶向Smad4抑制成骨细胞分化[24]。相反，miR-27a-3p可促进成骨标志物的表达[25]，并参与线粒体自噬和疾病进展的调控[26]。值得注意的是，BMSCs来源的外泌体miR-27a-3p已成为OP的潜在治疗介质，据报道在促进BMSCs成骨分化和调节成骨细胞与破骨细胞活性平衡方面发挥作用[27]，[28]。
在此基础上，本研究探讨了艾灸对OP作用的机制，特别关注BMSC来源外泌体miR-27a-3p与线粒体自噬之间的相互作用。我们检验了艾灸是否通过miR-27a-3p/PINK1轴调节BMSCs相关的miR-27a-3p表达和线粒体自噬相关信号传导，从而增强BMSCs的成骨分化并减轻OVX诱导的骨质流失。
章节片段
动物与伦理
健康无特定病原体（SPF）雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，9周龄，体重220±10g，购自成都达硕实验动物科技有限公司（许可证号：SCXK 2025-0030）。动物饲养于成都中医药大学实验动物中心屏障设施（许可证号：SYXK 2024-0049）内，环境条件受控（22-25°C，相对湿度55-60%，12小时光照/黑暗循环），自由摄食饮水
艾灸增加OVX大鼠骨量并促进成骨分化
为确定艾灸是否改善OVX诱导的OP，大鼠在去卵巢后第9周开始接受为期8周的艾灸干预。Micro-CT分析显示，与OVX组相比，OVX+MOX组骨量显著增加（图2A）。一致地，定量分析表明OVX+MOX组的骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）显著高于OVX组（图2B）。HE染色显示稀疏且断裂的
讨论
本研究探讨了艾灸是否促进BMSCs的成骨分化，并探索了潜在的分子机制。我们的研究结果表明，艾灸增加了OVX大鼠的骨量，改善了骨小梁微结构，增强了成骨分化，并伴随线粒体自噬活性的增加。使用Mdivi-1药理学抑制线粒体自噬减弱了艾灸对骨质流失和骨小梁完整性的有益效应，支持线粒体自噬的重要作用
结论
总之，本研究确定了艾灸通过BMSCs相关的miR-27a-3p增强线粒体自噬的潜在机制，从而保护线粒体功能、促进成骨分化并减轻OVX大鼠的骨质流失。这些发现提供了一个将艾灸与线粒体质量控制联系起来的分子框架，并提示miR-27a-3p-线粒体自噬轴可能代表OP的潜在治疗靶点。
CRediT作者贡献声明
Xing Li：方法学、概念化、写作-初稿。Xiao Li：方法学、概念化、写作-初稿。Adi Wirawan Tjahjono：方法学、概念化、写作-初稿。Xiaoli Chen：验证、软件、数据管理。Lu Cui：验证、软件、数据管理。Paradi Sangvatanakul：项目管理、方法学。Xiaojuan Hong：项目管理、写作-审阅与编辑。Xiang Li：监督、基金获取、写作-审阅与
伦理批准与参与同意
本研究经成都中医药大学动物福利与伦理委员会批准（批准项目标题：基于BMSCs来源miRNA-线粒体自噬轴探讨艾灸对BMSCs成骨分化的作用机制；批准号：2024133；批准日期：2024年9月4日）。
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经成都中医药大学机构动物伦理委员会批准（批准号：2024133）。
资助
本工作受中国四川省科学技术厅面上项目资助（基金号：2024NSFSC0729）。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
Xiang Li报告获得四川省科技支撑计划资助。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
Xing Li|Xiao Li|Adi Wirawan Tjahjono|Xiaoli Chen|Lu Cui|Paradi Sangvatanakul|Xiaojuan Hong|Xiang Li
成都中医药大学针灸推拿学院，成都 611137，中国
