升高的GANAB通过维持PD-L1稳定性，在膀胱癌中促进PD-1/PD-L1检查点介导的免疫逃逸

《Cellular Signalling》：Elevated GANAB fuels PD-1/PD-L1 checkpoint-mediated immune escape by maintaining PD-L1 stability in bladder cancer

　　摘要

背景：膀胱癌（BCa）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，晚期治疗选择有限且预后极差。尽管靶向PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂已获批用于临床，但客观缓解率仍然较低（15%–25%），且常出现获得性耐药。PD-L1介导的膀胱癌免疫逃逸的分子机制尚未完全阐明。PD-L1的翻译后修饰，特别是N-糖基化，可稳定蛋白并增强其免疫抑制功能；然而，在BCa中尚未系统鉴定调控该过程的具体酶类。

方法：我们利用公共数据库的单细胞测序数据鉴定恶性上皮亚群，并通过高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）、LASSO回归和机器学习构建预后模型。关键在于，我们开展了超越生物信息学预测的广泛实验验证：使用慢病毒介导的shRNA在MB49膀胱癌细胞中稳定敲低Ganab，并通过CCK-8和划痕愈合实验评估其对细胞增殖和迁移的影响。通过膀胱内接种MB49-荧光素酶细胞，在C57BL/6小鼠中建立原位膀胱癌模型，并使用活体生物发光成像监测肿瘤生长。对肿瘤组织进行单细胞RNA测序，以单细胞分辨率剖析肿瘤免疫微环境（TIME）。在机制层面，采用蛋白质印迹法、PNGase F去糖基化、免疫荧光和双向免疫共沉淀，阐明GANAB如何调控PD-L1糖基化。使用流式细胞术和CellChat分析评估T细胞亚群重塑及PD-L1/PD-1信号减弱情况。

结果：我们鉴定出一个以高肿瘤干细胞评分和广泛拷贝数变异为特征的恶性上皮亚群（Epi_3）。成功构建了包含15个基因的预后特征，其中GANAB的预测权重最高。GANAB蛋白表达沿肿瘤进展的拟时序轨迹逐渐增加。在实验方面，抑制Ganab显著抑制了MB49细胞体外增殖和迁移，并显著抑制了体内原位肿瘤生长。机制上，GANAB调控PD-L1的N-糖基化，产生两条明显的PD-L1条带：一条45 kDa的糖基化形式（Gly-PD-L1）和一条33 kDa的非糖基化形式（Non-gly-PD-L1）。免疫共沉淀证实，GANAB特异性地与非糖基化PD-L1（33 kDa）相互作用，但不与糖基化PD-L1（45 kDa）相互作用，表明GANAB与非糖基化PD-L1结合，并可能促使其进入内质网糖基化途径。对shGanab肿瘤组织的单细胞分析揭示了TIME的深刻重塑：耗竭T细胞（Tex）减少，效应记忆T细胞（Tem）增加，肿瘤细胞与T细胞亚群之间的PD-L1/PD-1信号减弱。SCENIC分析鉴定Stat1为关键上游转录因子，IMvigor210队列分析证实GANAB、STAT1、PD-L1和CD8A表达之间存在正相关。GANAB高表达患者表现出更差的免疫治疗反应和更差的预后。

结论：我们的发现通过整合单细胞和bulk转录组分析，为BCa患者建立了一个稳健的预后模型。更重要的是，我们通过体外和体内实验证明，核心基因GANAB通过调控PD-L1的N-糖基化，沿PD-1/PD-L1轴促进膀胱癌进展和免疫逃逸，从而重塑肿瘤免疫微环境。在TCGA队列中，GANAB表达与T细胞炎症基因表达谱（TEP；Spearman R = 0.85，P < 2.2e-16）强烈相关，表明GANAB高表达肿瘤代表一种炎症但免疫治疗耐药的表型。我们承认，GANAB与其他已确立生物标志物（包括肿瘤突变负荷和PD-L1联合阳性评分）之间的关系，以及其在正常组织中的表达谱，仍有待阐明。此外，目前尚无特异性GANAB抑制剂，且GANAB作为内质网管家酶广泛表达，引发潜在的靶点相关安全性问题，阻碍了直接的靶向治疗应用。因此，我们不主张直接抑制GANAB，而是提出GANAB可作为候选分层生物标志物和糖基化介导检查点耐药的机制节点。其临床实用性应与新兴疗法（如靶向铁死亡的纳米药物和抗体-药物偶联物）一并评估，未来的工作应聚焦于生物标志物验证和肿瘤特异性递送策略的开发，然后才能考虑任何治疗应用。

引言

膀胱癌在全球最常见恶性肿瘤中排名第十，每年约有57万新发病例和20万死亡病例，严重威胁人类健康[1]。根据肿瘤浸润深度，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）[2]，[3]。尽管经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）联合膀胱内化疗对NMIBC显示出良好的治疗效果，但约50%的MIBC患者在诊断时已出现远处转移，导致五年生存率低于50%。铂类化疗是转移性膀胱癌的标准一线治疗，但中位生存期仅为14–15个月，且伴有显著的毒副作用和频繁的耐药性[2]，[4]，[5]，[6]。近年来的研究进一步揭示，代谢重编程（如甲羟戊酸途径）在膀胱癌顺铂耐药中发挥重要作用，凸显了代谢脆弱性作为潜在治疗靶点的价值[5]。此外，新出现的证据表明，翻译后修饰酶如脯氨酰4-羟化酶β肽（P4HB）和TIMP-4与膀胱癌细胞迁移和侵袭有关，进一步说明了该病转移机制的复杂性[7]，[8]。近年来，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）为晚期膀胱癌患者带来了新希望[9]。阿替利珠单抗和帕博利珠单抗已获批用于铂类化疗失败后的二线治疗，以及不适合顺铂化疗患者的一线治疗。然而，客观缓解率仅为15%–25%，大多数患者最终会出现获得性耐药[10]。因此，深入了解膀胱癌免疫逃逸的分子机制，寻找新的治疗靶点和生物标志物，对改善患者预后具有重要的临床意义。

肿瘤免疫微环境（TIME）是一个由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和细胞外基质组成的复杂动态生态系统。肿瘤细胞通过各种机制重塑TIME以促进免疫逃逸，包括招募免疫抑制细胞（如调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞）、分泌免疫抑制细胞因子（如TGF-β和IL-10）以及上调免疫检查点分子（如PD-L1）[11]。在膀胱癌中，TIME的组成和功能状态与患者预后及免疫治疗反应密切相关[12]。

传统的bulk RNA测序技术只能提供组织水平的平均基因表达信息，无法解决细胞异质性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现彻底改变了这一领域，使其能够以单细胞分辨率同时检测数千个细胞的转录组，精确鉴定稀有细胞亚群，重建细胞发育轨迹，并推断细胞间通讯网络[13]，[14]。近年来，scRNA-seq已广泛应用于膀胱癌研究，揭示了显著的细胞异质性和复杂的免疫抑制微环境特征[15]，[16]。

程序性死亡配体1（PD-L1），也称为CD274或B7-H1，是B7家族成员，主要表达于肿瘤细胞、抗原提呈细胞和免疫细胞表面[17]。PD-L1与T细胞表面的PD-1受体结合后，激活下游SHP-1/SHP-2磷酸酶，从而抑制T细胞受体（TCR）信号通路。这导致T细胞功能耗竭、增殖受损和凋亡增加[18]，[19]。PD-L1的表达受到多层次的精确调控，包括转录水平（如STAT1、IRF-1和NF-κB等转录因子）、翻译水平（如miRNA调控）和翻译后修饰[20]，[21]，[22]。值得注意的是，更广泛的JAK/STAT信号级联，包括STAT3激活，也与膀胱癌进展和上皮-间质转化有关，进一步强调了STAT家族蛋白在膀胱癌生物学和免疫调节中的核心作用[23]。

翻译后修饰是调控蛋白活性的关键开关。研究表明，PD-L1存在广泛的N-连接糖基化修饰，主要发生在Asn192、Asn200和Asn219位点[24]，[25]。糖基化使PD-L1蛋白稳定，阻止其被内质网相关降解（ERAD）途径识别和降解，从而延长其半衰期并增强免疫抑制功能[26]。此外，糖基化还能影响PD-L1的亚细胞定位，促进其向细胞膜转运[27]。抑制PD-L1糖基化可增强抗肿瘤免疫反应，因此靶向调控PD-L1糖基化成为一种潜在的治疗策略。然而，PD-L1糖基化的调控机制尚未完全阐明。已知的调控因子包括EGF、CSN5和STT3A[20]，[21]，但催化PD-L1糖基化的特异性糖基转移酶和糖苷酶尚未被系统鉴定。特别是在膀胱癌中，PD-L1糖基化的调控网络几乎未知。

GANAB（葡萄糖苷酶IIα亚基），也称为α-葡萄糖苷酶II或GIIα，是内质网N-聚糖加工途径中的关键酶[28]。作为II型膜蛋白，GANAB与β亚基（GLU2B）形成异二聚体，催化N-连接糖基链上两个葡萄糖残基的连续水解：首先去除末端α-1,3-葡萄糖单位，然后裂解第二个α-1,3-葡萄糖单位[29]。这一步是糖蛋白正确折叠和质量控制的关键阶段；错误的糖基化可导致蛋白质在内质网中滞留和降解[30]。GANAB在多种肿瘤中异常表达。在肝细胞癌中，GANAB高表达与肿瘤大小、血管侵袭和不良预后相关[31]。在卵巢癌中，GANAB通过调控N-糖基化促进肿瘤进展[29]。然而，GANAB在膀胱癌中的表达模式、功能作用及分子机制尚未被研究。更重要的是，GANAB是否参与免疫检查点分子的糖基化修饰，从而调节肿瘤免疫微环境，完全未知。

基于上述背景，本研究提出以下科学假设：膀胱癌中存在以恶性上皮亚群为中心的肿瘤免疫逃逸单位，该亚群通过高表达特异性糖苷酶维持PD-L1糖基化，从而抑制T细胞功能；鉴定和靶向该糖苷酶可破坏免疫逃逸。为验证该假设，本研究采用以下技术路线：首先，利用单细胞测序阐明膀胱癌上皮细胞的异质性，并鉴定恶性程度最高的亚群。其次，通过整合单细胞模块基因、TCGA差异表达基因和恶性亚群特征基因，利用机器学习构建预后模型，以鉴定候选基因中的关键调控分子。此外，通过体外和体内实验验证该分子的致癌活性及其对免疫微环境的影响。然后，深入分析调控PD-L1糖基化的分子机制。最后，在临床免疫治疗队列中验证其对治疗疗效的预测价值。这种从现象到机制、从模型到临床应用的闭环设计，旨在为膀胱癌精准免疫治疗寻找新的靶点和生物标志物。

章节片段

数据来源与伦理声明

本研究使用的单细胞转录组数据来自GSE222315数据集[32]，其中包括9个膀胱癌样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。bulk转录组数据来自TCGA膀胱癌数据集（该队列包括19个正常膀胱组织样本和405个膀胱癌组织样本的转录组测序数据及相应临床信息：https://portal.gdc.cancer.gov/）[33]和GSE13507

鉴定高干性恶性上皮亚群Epi_3及核心预后基因GANAB

为鉴定膀胱癌进展和免疫逃逸的关键驱动因素，我们对单细胞和bulk转录组数据进行了整合分析。GSE222315数据集的单细胞分析鉴定出九个主要细胞群体，其中上皮细胞在肿瘤组织中较正常组织显著扩增（补充图S5）。通过提高聚类分辨率，我们鉴定了七个不同的上皮亚群（Epi_0至Epi_6），它们表现出相对

GANAB作为PD-L1糖基化修饰的关键调控酶

PD-L1的N-糖基化修饰近年来已成为肿瘤免疫逃逸研究的前沿领域。Li等人证明，N-糖基化可阻止SPOP介导的PD-L1泛素化和降解，维持蛋白稳定性，从而促进免疫逃逸[18]。然而，该研究仅证实了糖基化的功能意义，并未鉴定催化该修饰的特异性酶学机制。GANAB（葡萄糖苷酶IIα亚基）

CRediT作者贡献声明

Xuanxuan Jin：可视化、软件、资源、项目管理、方法学、形式分析。Yi Xu：调查、形式分析、数据管理。Keyu Ling：可视化、验证、项目管理、方法学。Haoyu Li：项目管理、方法学。Jianzhe Wang：验证、监督。刘洁瑜：写作——初稿，可视化，概念化。杨向绸：写作——初稿，可视化，验证，监督，资源。穆海琪：出版同意。所有作者均已同意出版本稿件。伦理批准与参与同意。所有动物实验方案均经中国科学院大学温州研究所机构动物护理与使用委员会批准（批准号：WIUCAS26051201），所有实验均按照机构指南进行。伦理声明。本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南。本研究经中国科学院大学温州研究所机构动物护理与使用委员会（WIUCAS）批准（批准号：WIUCAS26051201）。资金。作者声明，本研究和出版未获得任何财务支持。利益冲突声明。作者声明，不存在任何已知的竞争经济利益或个人关系，可能影响本文所报告的工作。致谢。我们感谢所有为GEO和TCGA数据库做出贡献的患者、研究人员、临床医生、技术人员和资助机构，正是他们使本研究成为可能。金璇璇|徐毅|凌可宇|李浩宇|王建哲|刘洁瑜|杨向绸|穆海琪。温州医科大学附属第二医院&育英儿童医院泌尿外科，温州，中国。