PjUGT67介导稀有齐墩果烷型拟人参皂苷RT1末端木糖基化及其在酿酒酵母中的从头生物合成

《Chinese Herbal Medicines》：Identification of a key glycosyltransferase and de novo biosynthesis of rare oleanane-type pseudoginsenoside RT1 in Saccharomyces cerevisiae

　　

目的：拟人参皂苷RT1（pseudoginsenoside RT1, RT1）是源于竹节参（Panax japonicus）的一种稀有齐墩果烷型（oleanane-type）人参皂苷，具有较好的药理开发潜力，但其应用受到天然丰度低和提取效率低的限制。本研究旨在鉴定与RT1生物合成相关的糖基化步骤，并构建用于其从头生产的工程化酵母菌株。
方法：研究人员以PjbAS1和PjbAS2为诱饵基因，通过共表达分析筛选候选尿苷二磷酸糖基转移酶（uridine diphosphate glycosyltransferase, UGT）基因，并进一步通过系统发育分析进行优先级排序。从P. japonicus中克隆PjUGT67，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行功能表征。研究人员考察了其酶学性质、底物特异性、供体偏好和亚细胞定位。为重构RT1生物合成，研究人员将相关通路基因逐步引入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），并联合异源尿苷二磷酸木糖（uridine diphosphate xylose, UDP-Xyl）供应模块，随后进行菌株优化和稳定性评价。
结果：PjUGT67被鉴定为一种能够催化竹节参皂苷IVa（chikusetsusaponin IVa, IVa）转化为RT1的UGT。该酶在35 ℃和pH 7.0时活性最佳，主要定位于细胞质，表现出较窄的受体特异性，并可利用UDP-Xyl和尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose, UDP-Glc）作为糖基供体。此外，PjCSLM和PjC28UGT被验证分别催化齐墩果酸（oleanolic acid, OA）转化为calenduloside E（CE）以及CE转化为IVa，从而明确了从OA到RT1的连续糖基化路线。通过在酵母中整合OA生物合成、连续糖基化和UDP-Xyl供应，研究人员构建了工程菌株RT1-02，并实现RT1从头生产17.34 mg/L。连续传代进一步确认了该工程菌株的遗传稳定性和生产稳定性。
结论：本研究为RT1此前尚未解析的木糖基化步骤提供了生化证据，鉴定并表征了PjUGT67作为参与末端糖基化步骤的功能性UDP-木糖基转移酶，并建立了基于酵母的RT1从头生产路线。这些发现为OA型人参皂苷的可持续生物合成和未来工程改造提供了新的酶资源和有用基础。

该研究围绕稀有齐墩果烷型（oleanane-type，五环三萜骨架）人参皂苷拟人参皂苷RT1（pseudoginsenoside RT1, RT1）的糖基化机制与微生物从头生物合成展开。人参属植物富含人参皂苷，人参皂苷可分为达玛烷型（dammarane-type, DM-type，四环三萜骨架）和齐墩果烷型（OA-type）两大类；DM型生物合成网络已有较多进展，而OA型通路研究相对不足。竹节参（Panax japonicus）富含OA型人参皂苷，是解析该类通路的理想材料，但其野生资源总体稀缺、分布局限，人工栽培尚处初期。RT1具有降压、降脂和抗癌等药理活性，然而自然分布窄、天然丰度低，且原植物生长周期长，传统提取纯化步骤多、溶剂消耗大，限制了其药理研究和规模化利用。微生物细胞工厂从头生物合成（de novo biosynthesis）为天然产物可持续生产提供了策略，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因食品安全性、遗传可操作性和工业稳健性而被广泛使用；此前酵母已成功生产多种DM型人参皂苷，而OA型微生物生产仅限于人参皂苷Ro，并暴露出糖基转移酶效率、支路通量分配以及UDP-葡萄糖醛酸（uridine diphosphate glucuronic acid, UDP-GlcA）与UDP-葡萄糖（uridine diphosphate glucose, UDP-Glc）供应平衡等瓶颈。RT1拟议路线为2,3-氧化角鲨烯经齐墩果酸（oleanolic acid, OA）依次糖基化为calenduloside E（CE）、竹节参皂苷IVa（chikusetsusaponin IVa, IVa），最终形成RT1；前两步已由PgCSyGT1和PgUGT8分别催化OA→CE和CE→IVa，但RT1形成所需的末端木糖基化步骤尚未解析。与Ro不同，RT1生物合成还需要UDP-木糖（uridine diphosphate xylose, UDP-Xyl）依赖的末端糖基化，因此鉴定相应木糖基转移酶并建立足够的胞内UDP-Xyl供应十分关键。该研究发表于《Chinese Herbal Medicines》。
研究人员开展了候选UGT筛选、PjUGT67克隆与功能表征、PjCSLM和PjC28UGT功能验证，以及酵母通路重构与菌株优化。结果鉴定PjUGT67为催化IVa→RT1的UDP-木糖基转移酶，明确了OA→CE→IVa→RT1的连续糖基化路线，并构建工程菌株RT1-02实现RT1从头生产17.34 mg/L。该研究为RT1末端木糖基化提供生化证据，建立了微生物RT1生产路线，并为OA型人参皂苷生物合成与工程改造提供酶资源和工程基础。
关键技术方法概括（不超过250字）：关键技术包括以PjbAS1/PjbAS2为诱饵的转录组共表达分析（Pearson r≥0.6）和系统发育分析；PjUGT67克隆、大肠杆菌异源表达、蛋白纯化及体外酶促反应，结合HPLC和LC-MS鉴定产物；烟草瞬时表达进行亚细胞定位；AlphaFold3和AutoDock-Vina分子对接；酵母基因组整合、Cre/loxP标记回收、摇瓶发酵及代谢物HPLC/LC-MS分析。样本来源：P. japonicus采自中国湖北恩施土家族苗族自治州，2021年8月采集，由Professor Zhengtao Wang鉴定；取根茎、侧根、茎和叶四种组织，每组织三个独立生物学重复，样本存放于上海中医药大学中药研究所。
3.1 关键功能基因挖掘：OA型人参皂苷在P. japonicus中呈组织特异性分布，根茎最高、侧根中等、茎叶仅痕量；PjbAS1和PjbAS2表达模式与之高度一致。研究人员以二者为诱饵进行共表达分析，结合NR注释和系统发育分析获得79个候选UGT；候选分布于多个UGT家族，其中UGT73家族与五环三萜糖基化关系密切。PjUGT67和PjUGT186位于UGT73家族，但PjUGT186预测编码序列明显短于典型植物家族1 UGT，可能为不完整或截短转录本；PjUGT67为全长UGT，因此被列为最高优先级候选。
3.2 PjUGT67的功能表征：研究人员从P. japonicus根茎cDNA扩增PjUGT67编码序列，在大肠杆菌中表达带N端6 × His标签的重组蛋白并纯化，SDS-PAGE显示融合蛋白表观分子量约108.5 kDa。以IVa和UDP-Xyl进行体外反应后，HPLC检测到与RT1标准品保留时间一致的新产物；LC-MS碎片离子包括m/z 926.3443 [M?H]^?、m/z 763.3120 [M?H?Glc]^?、m/z 613.2803 [M?H?Glc?Xyl?H₂O]^?和m/z 455.2822 [M?H?Glc?Xyl?GluA]^?，与RT1标准品特征碎裂一致。由此证明PjUGT67为可催化IVa转化为RT1的UDP-木糖基转移酶；原文同时指出，仍需原位植物遗传验证其生理作用。
3.3 PjUGT67的酶学性质与亚细胞定位：该酶最适温度为35 ℃、最适pH为7.0；以IVa为受体时，K_m为20.1 μmol/L，k_cat为4.69 × 10^?4 min^?1，k_cat/K_m为2.33 × 10^?5 μmol/(L·min)，显示对IVa亲和较好但周转较慢。受体特异性较窄，仅CE和IVa被木糖基化，其他五环三萜、四环三萜、甾醇和黄酮类未检测到活性；供体方面可利用UDP-Xyl和UDP-Glc，而不利用UDP-GlcA、UDP-阿拉伯糖（UDP-Ara）和UDP-鼠李糖（UDP-Rha）。PSPG基序（Plant Secondary Product Glycosyltransferase motif）末端残基为谷氨酰胺Q391，与28个已报道木糖基转移酶中该末端谷氨酰胺高度保守一致；分子对接显示Q391最靠近UDP-Xyl和UDP-Glc。烟草表皮细胞瞬时表达EYFP融合蛋白显示PjUGT67主要定位于细胞质。结论认为PjUGT67是胞质UGT，具有窄受体特异性和部分宽松的供体特异性，适合催化IVa→RT1末端糖基化，但其原生组织定位仍需进一步验证。
3.4 酵母中RT1的生产：研究人员在酿酒酵母CEN.PK2-1C中组装OA生物合成、连续糖基化和UDP-Xyl供应三个模块。过表达GgbAS、MtOAS和MtCPR并删除GAL80构建OA-01，产OA 59.87 mg/L；进一步过表达tHMG1、ERG1和ERG9并删除GAL1构建OA-02，产OA 101.08 mg/L；第二轮过表达上述基因构建OA-03，OA产量达124.95 mg/L。将AtUGD1^A101L与PjCSLM共表达构建CE-01-A101L，产OA 79.09 mg/L和CE 32.68 mg/L；再引入PjC28UGT、PjUGT67和AtUXS3构建RT1-02，成功生产RT1 17.34 mg/L，产物身份经与标准品保留时间比较支持。RT1-02发酵中OA和CE明显积累而IVa较低，表明代谢通量向终产物转移不充分；原文讨论认为可能与异源表达UGT催化性能不足以及UDP-Glc、UDP-GlcA和UDP-Xyl供应协调不足有关。连续传代至G2、G4、G6、G8和G10，PCR可稳定扩增所有异源基因，RT1持续生产且无明显产量 loss，支持菌株遗传与表型稳定性。
讨论部分总结：原文围绕PjUGT67的催化效率、底物识别、供体偏好、亚细胞定位及酵母通路瓶颈进行讨论。PjUGT67对IVa亲和较好但k_cat较低，整体催化效率有限，可能受异源表达折叠或天然胞内环境缺失影响；其窄受体特异性与齐墩果烷骨架及C-3糖链识别有关，而C-28糖取代具有一定耐受性；PSPG末端Q391及对接结果为其利用UDP-Xyl和UDP-Glc提供序列与结构层面的解释；胞质定位与中性pH最适相一致，上游P450氧化反应与胞质UGT之间存在空间分隔，可能影响异源系统转化效率。酵母生产中RT1滴度较低，原文指出需强化前体通量和UDP-Glc/UDP-Xyl供应，改进关键UGT催化性能，并进行发酵优化与放大评价。
研究结论翻译：本研究鉴定PjUGT67为参与末端糖基化步骤的候选UDP-糖基转移酶，并支持P. japonicus中RT1的拟议糖基化路线。结合PjCSLM和PjC28UGT的功能验证，结果为OA到CE、IVa并最终到RT1的连续糖基化步骤提供生化证据。基于这些发现，通过整合OA生物合成、逐步糖基化和UDP-Xyl供应，建立了基于酵母的RT1从头生物合成系统。工程菌株RT1-02成功生产RT1，产量为17.34 mg/L，证明微生物生产RT1的可行性。总体而言，该工作为拟议的RT1糖基化途径提供生化支持，建立微生物RT1生物合成的实用路线，并为未来OA型人参皂苷生物合成与生产研究提供有用的酶和工程资源。