儿童及年轻成人1型强直性肌营养不良（DM1）肠道微生物组初步研究：同胞配对16S rRNA分析显示Faecalibacterium相对丰度降低

《Journal of Neuromuscular Diseases》：Exploring the gut microbiome in children and young adults with myotonic dystrophy type 1

　　

1型强直性肌营养不良（DM1）是一种复杂多系统疾病，患病儿童常出现胃肠（GI）和神经发育问题。尽管这些症状患病率较高，其潜在机制仍知之甚少。已知肠道微生物组参与胃肠和神经发育障碍，新兴研究提示其也可能在多种神经肌肉疾病中起促成作用。然而，DM1儿童的肠道微生物群尚未被探索。本初步研究比较了10名DM1儿童和1名DM1年轻成人的肠道微生物群谱与其未患病同胞（n=11）。收集三日食物记录和粪便样本，并通过16S rRNA标记基因测序（16S rRNA marker-gene sequencing）分析细菌分类群。采用家庭内配对样本设计控制饮食和生活方式等潜在混杂因素。结果显示，两组总体微生物多样性和群落结构相似。此外，与未患病同胞（均值9.1% ± 4.4%）相比，DM1参与者Faecalibacterium属相对丰度显著较低（均值4.9% ± 2.1%）（p=0.005）。该发现应视为探索性，因其单变量分析（univariate analysis）未进行多重检验校正（multiple testing correction）。Faecalibacterium是一种关键肠道细菌，在多种DM1相关胃肠和神经发育障碍中已报道其丰度降低。虽然不能从这项探索性研究推断因果关系（causality），但观察到的降低可能与DM1中常见的胃肠和神经发育挑战相关。若更大规模进一步研究证实其作用，靶向Faecalibacterium相对丰度可能成为缓解DM1胃肠和神经发育症状的潜在治疗策略（therapeutic strategy）。

研究背景：1型强直性肌营养不良（myotonic dystrophy type 1，DM1；一种由DMPK基因CTG三核苷酸重复扩增所致的常染色体显性多系统神经肌肉疾病）临床表现高度异质。成人以肌无力、肌强直和疲劳为主，而儿童常首先表现为认知行为问题、疲劳和胃肠（GI）障碍，且胃肠症状对日常生活影响较大。尽管儿童DM1患者CTG重复长度相近，其胃肠症状和其他临床表现差异仍很大，提示遗传之外因素参与疾病修饰。肠道微生物组（gut microbiome；肠道内细菌、病毒和真核生物等微生物群落）参与营养吸收、能量代谢、神经信号、肠道内分泌和免疫等功能，其组成改变与肌萎缩、孤独症谱系障碍（ASD）、糖尿病、心律失常、注意缺陷多动障碍（ADHD）、胃肠障碍及肠易激综合征（IBS）等相关。肠道-肌肉轴研究提示肌肉功能、代谢与肠道微生物组相互依赖，且神经肌肉疾病中已有微生物组改变报道。Mahdavi et al.报告成人DM1患者肠道微生物组结构变化，并提出其与胃肠症状可能相关。然而，儿童DM1肠道微生物组尚未被探索。因此研究人员开展病例对照研究，比较DM1儿童及年轻成人与未患病同胞的粪便微生物群多样性和组成，以提供儿童DM1肠道微生物组作用的初步见解。
研究方法：研究人员在荷兰Radboud大学医学中心Amalia儿童医院招募2.5—21岁DM1患者及同住未患病同胞，并额外纳入1名23岁未患病同胞以保持配对；所有参与者均经DM1基因检测。排除近3个月使用抗生素或益生菌、近1个月重大用药或饮食改变，以及重大慢性肠、代谢、炎症或呼吸疾病、糖尿病、恶性肿瘤和近1年母乳喂养者。采集三日饮食记录和粪便样本，以儿童荷兰健康饮食指数（Paediatric Dutch Healthy Diet index，PDHD-index）评估饮食，以Bristol粪便形态量表记录粪便形态，并以16S rRNA V4区标记基因测序、QIIME2和DADA2进行扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASV）去噪及SILVA-138分类；采用家庭内配对分析及Wilcoxon符号秩检验等比较DM1与同胞微生物组成；因探索性未作多重检验校正。
研究结果：
3.1 研究人群一般特征：共纳入22名参与者，其中DM1组11名（10名儿童和1名年轻成人；6女5男，平均年龄11.0 ± 5.2岁；8例童年型、3例先天型），未患病同胞11名（7女4男，平均年龄10.1 ± 6.1岁）。通过配对比较发现，两组年龄、身高、体重、BMI（kg/m²）、用药、共病和出生方式无显著差异；但家庭内配对在胎龄、粪便形态和腹痛频率上存在显著差异，DM1参与者胎龄较低且腹痛更频繁。
3.2 饮食记录与PDHD指数：通过三日饮食记录计算PDHD-index，未报告饮食限制；总体PDHD-index均值为30.4 ± 9.3，DM1组30.6 ± 9.0与同胞组30.3 ± 10.5无显著差异，各饮食成分亦无显著差异；家庭内变异较小而家庭间差异更明显，因此微生物分析无需进行饮食校正。
3.3 测序过程：对22份粪便样本提取微生物gDNA并测序16S rRNA基因V4区，获得原始序列读数18,254,601条；质控后保留67.0%，平均读长247.9 ± 0.60 bp；每样本平均保留552,500 ± 76,660条读数用于分类，95.11% ± 1.66%的读数可分类至属水平。
3.4 属水平肠道微生物组组成：通过属水平组成分析显示，两组最丰富属均为Bifidobacterium和Bacteroides，DM1组平均相对丰度分别为18.84%和11.32%，同胞组分别为17.37%和10.55%。DM1组第三丰富属为Prevotella（9.84%），其后为Faecalibacterium（4.95%）、Subdoligranulum（4.06%）、Blautia（3.31%）、Akkermansia（2.40%）和Ruminococcus（2.67%）；同胞组第三至第八丰富属为Faecalibacterium（9.08%）、Prevotella（8.84%）、Akkermansia（4.12%）、Blautia（3.49%）和Subdoligranulum（2.76%）。前八位丰富属组成在两组间不同；组间Wilcoxon符号秩检验显示DM1参与者Faecalibacterium相对丰度显著较低（p=0.022）。Bifidobacterium和Prevotella在样本间变异较大，但两组变异程度相当。
3.5 Faecalibacterium相对丰度显著差异：通过每个DM1参与者与其未患病同胞的配对分析（非参数Wilcoxon符号秩检验）发现，DM1儿童和年轻成人Faecalibacterium相对丰度显著降低（p=0.0048），均值4.95% ± 2.14%对9.08% ± 4.45%，平均log₂ fold change为-0.87 ± 0.86；该属在同胞组中为第三丰富属，在DM1组中为第四丰富属。
3.6 肠道微生物多样性与群落结构：通过α多样性（alpha diversity；样本内物种多样性）Shannon和Faith指数评估，Mann-Whitney U检验显示DM1参与者与同胞无显著差异。通过基于加权UniFrac距离的主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）评估β多样性（beta diversity；样本间群落结构差异），未显示两组明显聚类；PERMANOVA分析未发现微生物群落结构显著差异（p>0.05）。主成分分析（principal component analysis，PCA）显示PC1和PC2合计解释73.9%的方差，Prevotella和Bifidobacterium分别主要贡献PC1和PC2，PC1和PC2未将DM1与同胞分开。冗余分析（redundancy analysis，RDA）显示家庭（family）是主要方差解释因素，解释33.7%的方差；家庭、BMI、年龄、腹痛和粪便量表等因素虽解释一定方差，但均未达统计显著。
讨论部分总结：该研究为首次检查儿童和年轻成人DM1肠道微生物群组成，发现DM1参与者Faecalibacterium相对丰度显著低于未患病同胞，但总体细菌多样性和群落结构无差异。Faecalibacterium属于厚壁菌门（Firmicutes），是肠道主要丁酸（butyrate）产生菌，丁酸具有抗炎特性；其丰度降低也见于IBS、ADHD等DM1常见共病，ASD研究结果不一致。与Mahdavi et al.的成人DM1研究相比，α多样性无差异的结果一致；β多样性结果不同可能与对照是否为相关个体有关，而同胞间微生物群落相似性可能掩盖疾病相关差异。RDA提示家庭因素解释最多方差，疾病状态解释最少，强调家庭内匹配的重要性。研究优势包括同胞配对设计可控制遗传、居住、民族、环境和饮食因素，详细询问显示配对内年龄、BMI、出生方式和用药无差异，排除抗生素使用者，且所有参与者均经DM1基因检测。局限包括样本量小、统计功效有限、无法构建多变量模型、未进行多重检验校正、Illumina NovaSeq平台分箱质量分数可能影响DADA2默认设置、两个家庭DM1与同胞数量不等导致2名参与者被配对两次，以及观察性设计不能确定因果关系。未来研究应优先家庭内匹配尤其是同胞对照、更严格年龄匹配、扩大样本量、关注便秘，并结合宏基因组、宏转录组和蛋白质组学；若Faecalibacterium降低被证实，调节其丰度可能成为缓解DM1胃肠和神经发育症状的策略。
研究结论翻译：总体而言，研究结果表明DM1儿童和一名年轻成人的肠道微生物组丰度存在差异，尤其以最丰富细菌属之一Faecalibacterium减少为标志。log₂ fold change为-0.87提示DM1参与者Faecalibacterium丰度较未患病同胞约低46%。然而，这些发现应视为探索性。既往研究已将Faecalibacterium与DM1症状及DM1常见疾病相关联，但其变化在DM1发病机制中发挥直接作用还是继发效应仍不清楚。此处呈现的见解可为缓解DM1相关神经发育和胃肠症状的新方法和治疗策略铺路。