流变学调控的扩散调节费氏弧菌的群体感应

《APS Open ScienceNEW》：Rheologically tuned diffusion modulates quorum sensing in Vibrio fischeri

　　理解流体的物理性质如何影响细菌行为，对于解释微生物如何与其环境及动物宿主相互作用至关重要。在这里，我们研究流体粘度和流变性质的改变如何影响海洋细菌费氏弧菌的运动能力及其通过细胞间通讯产生发光的能力。我们追踪了在具有不同物理性质的明确流体中单个细胞的三维运动，并测量了细胞群体发出的发光强度。我们发现，粘度较高的流体导致费氏弧菌更多地处于一种较慢的、以转向为主的游动模式，这降低了细胞扩散并遇到激活发光所需化学信号的有效性。结果，在牛顿流体中，发光强度先增加后降低，但在表现出非牛顿流变行为的流体中则单调下降。基于我们测量结果的计算机模拟证实，细胞探索周围环境的能力在决定它们何时以及以多强的方式进行通讯方面起着核心作用。这些发现揭示了物理环境、细菌运动和集体行为之间的直接联系，并为微生物如何适应复杂的流体栖息地（包括动物宿主体内的栖息地）提供了见解。I. 引言微生物栖息在物理性质多样的液体环境中，周围流体的物理性质强烈影响它们在多个空间和时间尺度上导航、感知和通讯的能力[1–4]。粘度、弹性和剪切稀化行为不仅塑造了游动细胞所受的流体动力，还影响信号分子的运输[5,6]、积累[7]和感知，这些信号分子协调集体行为[8,9]。这种物理约束在自然栖息地中无处不在，包括海洋雪[10,11]、宿主粘液层[12,13]和富含聚合物的生物分泌物，其中流体通常偏离牛顿行为并表现出复杂的流变响应[14,15]。因此，理解环境流变学如何调节细胞运动和化学通讯，对于将微观运动性与生态及宿主相关功能联系起来至关重要。流体-细胞相互作用生态相关性一个引人注目的例子是费氏弧菌与夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）之间的二元共生关系[16–18]。新孵化的乌贼依赖活动的费氏弧菌细胞穿越异质的、富含粘液的环境，到达发光器官，在那里成功定殖需要细胞在空间受限的隐窝中积累、持久存在并进行通讯[19–21]（见补充材料图S1[22]）。在细胞水平上，如图1(a)所示，展示了费氏弧菌的群体感应（QS）激活的生物发光机制。在细胞和信号密度较低时，LuxR保持非活性状态；在较高密度下，自诱导物分子的积累激活LuxR结合到lux型盒上，触发生物发光。在特定的微环境中，自诱导物分子的积累激活QS，触发生物发光，使乌贼能在夜间进行反向照明[23,24]。因此，这一标志性的共生关系例证了细菌运动性、环境物理性质和QS激活之间的紧密耦合，但控制这种耦合的物理原理仍未完全理解。图1. 粘度依赖性的费氏弧菌群体感应介导生物发光的调节。(a) 示意图说明费氏弧菌的QS激活生物发光机制。(b) 观察生物发光强度随溶液流变性质变化的实验装置示意图。(c) 在含有PVP360k（牛顿流体，上排）和Methocel（下排）不同粘度的运动缓冲液中，固定细胞浓度的细菌悬浮液的生物发光强度代表性伪彩色图像。色标表示发光强度。在PVP360k [面板(d)]和Methocel [面板(e)]含运动缓冲液中，粘度从1到2 cP时，空间平均发光强度的时间演变。实心点表示平均强度，阴影区域表示五次独立实验的标准差。平均发光强度对粘度呈现非单调依赖，在中间粘度时达到最大值。比例尺：。先前的研究已经确定，细菌运动性对流体流变学高度敏感。在牛顿流体中，粘度增加通常会通过增强流体动力阻力来降低游动速度[25–28]。相反，稀聚合物溶液可以产生非直观的响应：例如，已报道大肠杆菌在某些剪切稀化聚合物溶液中游动更快，与在牛顿流体中的行为形成对比[29–31]。这些发现表明，复杂流体对细菌运动的影响是物种特异性的，并取决于细胞形态、鞭毛结构和运动调控。尽管在费氏弧菌的QS电路和生态作用方面已有大量工作，但其运动性如何响应非牛顿的、类似粘液的环境，以及这种响应如何反馈到QS介导的行为，仍未得到充分探索。费氏弧菌的一个显著特征是其多态游动行为，其特征在于由鞭毛缠绕机制实现的“游动-逆转”和“游动-暂停-逆转”模式。在“游动-逆转”模式中，鞭毛马达旋转的逆转将鞭毛束在推和拉构型之间切换，导致细胞突然逆转其游动方向，并大致沿其先前的路径前进。在“游动-暂停-逆转”模式中，鞭毛束在两个方向相反的游动之间转换时暂时缠绕在细胞体周围。由于在缠绕构型中推进力显著降低，这种中间状态在细胞轨迹中表现为暂停。细胞随后在鞭毛束解开并恢复延伸构型后，以相反方向或重新定向的方向恢复直线游动[32]。这些游动模式产生大的重定向角，并强烈影响细胞有效探索受限或结构化空间的能力[33–36]。由于QS激活依赖于信号分子随时间的积累，细菌群体的长期有效扩散（而非仅仅瞬时游动速度）很可能控制生物发光的起始和空间组织[30,37,38]。然而，这种类似扩散的行为如何从粘度依赖的游动动力学中出现，特别是在粘弹性应力下，尚未被实验量化。在这里，我们研究了流体流变性质如何调节费氏弧菌的游动行为和QS介导的生物发光。使用聚（乙烯基吡咯烷酮）（PVP； kDa，记为PVP360k）的牛顿溶液和在此处使用的浓度下表现出弱剪切依赖性流变行为的甲基纤维素（Methocel）溶液，我们结合了单个细胞的实时三维（3D）追踪和群体水平的QS驱动发光测量。PVP360k和Methocel溶液的流变性质见补充材料图S2[22]。通过量化一系列粘度下的运动模式比例、游动持续时间、重定向统计和游动速度，我们推导出费氏弧菌的有效扩散系数，并将其直接与QS激活联系起来。将细菌运动与粘度依赖的分子扩散耦合的补充模拟再现了观察到的发光趋势，揭示了流体流变学如何通过其对长时间输运统计的影响来调节集体细菌信号传导。总之，我们的结果确定有效扩散是单细胞运动性和QS控制的共生功能之间的物理桥梁。II. 结果与讨论 A. 液体粘度对QS介导生物发光的影响为了研究流体流变性质如何影响费氏弧菌的QS调节生物发光，我们使用PVP360k（其保持介质为牛顿流体）和Methocel（其在足够聚合物浓度下引入剪切稀化和粘弹性特性）来系统地调节周围介质的物理性质[29]。在本实验中使用的相对较低的Methocel浓度下，重复的体相流变测量显示，随着剪切速率的增加，粘度仅出现弱下降（补充材料图S3[22]）。然后，我们检查了在固定细胞浓度下，不同粘度下细菌悬浮液生物发光强度的变化。培养超过24小时的细胞被收获、离心，并以固定细胞浓度重悬于运动缓冲液中（详细信息见补充材料[22]）。如图1(b)所示，将小瓶放置在暗室中，彩色相机通过连续成像记录生物发光强度和持续时间。我们发现，在含有PVP360k和Methocel的介质中，粘度依赖的发光响应在性质上不同[图1(c)]。对于悬浮在含PVP360k运动缓冲液中的细菌，生物发光强度随粘度增加先增加后降低，在粘度为1.5 cP时达到最大值。相比之下，对于含Methocel运动缓冲液中的细菌，平均发光随粘度单调下降。图1(d)和1(e)显示了发光区域平均强度的时间演变。通过均匀摇动样品并将其置于观察室中，这被记录为 。平均发光强度取决于运动缓冲液的粘度和流变性质，而生物发光的总体持续时间与这些因素无关。在含有PVP360k和Methocel的缓冲液中，生物发光在观察的前7-8分钟缓慢衰减，并在约13分钟后降至最低水平。由于费氏弧菌的荧光素酶催化的生物发光反应需要分子氧[39,40]，我们推断这种整体衰减主要源于介质中溶解氧的逐渐消耗。随着氧变得有限，生物发光强度下降得更快。这种明显的粘度依赖性发光强度调节促使我们进一步检查单个费氏弧菌细胞的游动行为。 B. 复杂流体对费氏弧菌游动速度的影响首先，我们对费氏弧菌细胞进行鞭毛剪切，以研究运动性丧失是否影响QS期间的生物发光。结果如图2(a)所示，显示剪切细胞的平均生物发光强度显著低于对照组。这表明运动性丧失对QS期间的生物发光有负面影响。有趣的是，两组之间的生物发光持续时间不同。与对照组相比，剪切细胞表现出延长的生物发光持续时间，在大约12分钟后逐渐下降，并在大约17分钟时达到最低水平。我们假设这种延长的生物发光是由于固液界面处的流体动力吸引和细胞的趋氧性所致。为了进一步探讨这一点，我们分析了QS期间对照组和剪切细胞中沿 方向的生物发光强度变化。图2(b)显示，对照组在QS初期沿 方向最初表现出均匀的生物发光分布。然而，在大约10分钟时，观察到亮度显著偏差，在 和 附近比中心区域更强，随后整体亮度降至低水平。图2(c)显示，在剪切细胞中，沿 方向的亮度分布在生物发光衰减过程中保持相对均匀。图2. 在无聚合物的TMN运动缓冲液中，对照组和剪切细胞随时间及不同 位置的平均发光。阴影区域表示独立实验的标准差。(a) 对照组和剪切细胞的时间依赖性平均发光。(b) 不同时间点（包括0、5、10和15分钟）跨不同 位置的平均发光。(c) 对剪切细胞在相同时间点的类似分析，显示衰减过程中位置依赖的发光分布。我们通过使用实时3D追踪显微镜追踪每个单个细胞10秒，测量并分析了费氏弧菌在具有不同流体性质的运动缓冲液中的游动行为[28]。为了阐明这种粘度依赖性减速的起源，我们进一步检查了单个细胞的运动模式。如图3(a)所示，与推和拉模式相比，进入缠绕模式伴随着瞬时游动速度的显著降低。图3(b)显示了在无添加聚合物的 -NaCl（TMN）运动缓冲液中费氏弧菌的代表性3D轨迹。运动模式根据平滑后的三维轨迹，基于游动方向和瞬时速度的变化进行识别，如第IV E节所述。很明显，细胞在缠绕过程中始终表现出显著的减速和角偏转。我们分析了在无任何添加聚合物的运动缓冲液中缠绕前后的角度变化直方图，发现转向角集中在140°左右[图3(c)]。我们通过使用实时3D追踪显微镜追踪每个单个细胞10秒，测量并分析了费氏弧菌在具有不同流体性质的运动缓冲液中的游动行为[28]。为了阐明这种粘度依赖性减速的起源，我们进一步检查了单个细胞的运动模式。如图3(a)所示，与推和拉模式相比，进入缠绕模式伴随着瞬时游动速度的显著降低。图3(b)显示了在无添加聚合物的TMN运动缓冲液中费氏弧菌的代表性3D轨迹。很明显，细胞在缠绕过程中始终表现出显著的减速和角偏转。我们分析了在未添加任何聚合物的运动缓冲液中，细菌在包裹前后角度变化的直方图，发现转向角集中在140°附近[图3(c)]。图3. 不同黏度和游泳模式下费氏弧菌游泳行为的表征。(a) 游泳模式示意图：拉、包裹和推。(b) 费氏弧菌的三维轨迹，颜色梯度表示速度。黑色箭头表示鞭毛旋转方向。橙色、蓝色和黄色箭头分别代表拉、包裹和推模式下细菌的游泳方向。右侧带箭头的圆形符号说明了三种游泳模式对应的马达旋转方向。(c) 转向角的概率分布函数（PDF），展示了运动过程中转向角的分布。(d) 在PVP360k和Methocel溶液中，不同黏度下费氏弧菌的速度，误差线表示变异性。(e) 在PVP360k和Methocel中，不同黏度下推/拉模式与包裹模式的时间比例，显示随着黏度增加，模式偏好发生变化。

在添加PVP360k的运动缓冲液中，平均游泳速度随着黏度的增加而单调下降，这与牛顿流体的预期一致。因此，我们对三维轨迹进行分段，以量化在不同黏度下每种运动模式所占的时间比例以及相应的模式分辨游泳速度。图3(d)显示，在直线游泳模式（推和拉）以及包裹模式下，游泳速度均下降。在牛顿流体中，观察到的游泳速度随黏度增加而下降的现象，可以用阻力理论（RFT）框架来合理解释，详见补充材料中的图S3[22]。根据相同的RFT参数，估计旋转鞭毛附近的局部剪切速率可达每秒数千。有趣的是，在相同黏度下，Methocel溶液中的游泳速度低于牛顿PVP360k溶液，无论是在直线游泳模式（推和拉）还是在包裹模式下。这些在匹配体积黏度下的差异表明，细菌的运动响应不能仅由体积黏度来解释。在图3(e)中，在含有PVP360k和Methocel的缓冲液中，包裹模式的概率随黏度的增加而系统性增加。这一趋势与先前的研究一致，即增加的黏性阻力促进了鞭毛包裹事件的发生[32]。然而，与先前关于大肠杆菌的研究[29–31]不同，费氏弧菌在剪切稀化流体中并未表现出随黏度增加而增强的游泳速度。

C. 扩散与生物发光之间的关系

先前的研究表明，一旦细胞遇到足够高的局部信号分子浓度，费氏弧菌的群体感应（QS）就会被激活，从而导致生物发光的产生[41,42]。这表明细胞探索周围环境的效率在QS激活中起着关键作用，可以通过有效扩散系数来定量表征[30,43]。需要注意的是，QS激活既受信号产生和积累的生化调控控制，也受决定细胞-信号相遇的物理传输过程的影响。在这里，我们特别关注后者，而不暗示有效扩散单独决定QS激活。费氏弧菌的游泳行为包括以速度 的直线游动，间歇性地被与鞭毛包裹和解包相关的重新定向事件打断。这些重新定向事件的特征是游动持续时间 、包裹时间 和转向角 [图4(a)]。补充材料中的图S4和S5分别提供了在不同质量分数下PVP360k和Methocel溶液中 和 分布的直方图[22]。此外，在所有黏度下，包裹持续时间 始终远短于相应的游动时间 。轨迹统计分析表明，游动持续时间的分布符合指数形式，支持重新定向事件的泊松描述[44]。

图4. 费氏弧菌的运动统计、有效扩散及其与群体感应活性的联系。(a) 用于表征细胞重新定向和环境探索的运动统计示意图。推和拉模式中的直线游动被持续时间 的包裹事件间歇打断，导致由转向角 和有效游动持续时间 表征的重新定向。代表性轨迹说明了不同的运动统计如何导致较小或较大的有效扩散系数 。(b) 平均游动持续时间 随黏度的变化。(c) 平均转向角随黏度的变化。(d) 平均转向角作为包裹持续时间 的函数，细胞在含PVP360k和Methocel的运动缓冲液中游动。虚线表示数据的指数拟合。(e) 根据测得的游泳速度、游动持续时间和转向角统计计算出的有效扩散系数 。误差线表示标准误差。(f) 实验测得的归一化平均发光强度与基于细胞和信号分子之间扩散控制相互作用模型的模拟结果之间的比较。

利用测得的三维轨迹，我们在每种黏度下提取了 和转向角统计，对两种运动缓冲液均如此。在PVP360k和Methocel溶液中，平均游动持续时间和平均转向角均随黏度的增加而单调下降[图4(b)和4(c)]。平均转向角随 的增加而系统性下降，且这种依赖关系在含PVP360k和Methocel的缓冲液中均能很好地用指数拟合描述[图4(d)]，表明更长的包裹事件导致更持久的游泳方向[36]。细菌探索环境的能力可以通过有效扩散系数来表征，由 给出[44]。将测得的这些量代入方程得到有效扩散系数 。如图4(d)所示，在含PVP360k的牛顿流体中， 随黏度呈非单调依赖，而在含Methocel的黏弹性流体中，则随黏度单调下降。

为了将这些传输特性与QS活性联系起来，我们量化了相同浓度细胞群体在发光期间的平均发光强度。发光强度对黏度的依赖性与两种运动缓冲液的有效扩散系数密切对应[图4(d)和4(e)]。我们采用简化的基于扩散的模型来模拟代表性实验条件下（ ）费氏弧菌细胞与周围信号分子在边长为 的立方域中的相互作用。在该模型中，细胞主动运动由两种运动缓冲液中不同黏度下测得的有效扩散系数描述，而信号的被动运动则使用小分子的黏度依赖扩散系数建模。归一化的信号-细胞相遇事件数用于量化发光强度。如图4(e)所示，模拟重现了整体实验趋势。总之，这些结果表明，由有效扩散系数量化的细胞“搜索效率”是连接运动统计与QS激活生物发光的关键物理因素。

III. 结论

在本研究中，我们考察了液体黏度和流体流变学如何调控费氏弧菌中QS介导的生物发光，假设是黏度依赖的细菌运动变化——而非单独的黏度——控制信号相遇和积累的效率。通过系统比较具有匹配体积黏度的含PVP360k和Methocel的流体，我们旨在建立微生物传输、运动模式和QS激活之间的物理联系，这些来自实验和建模。我们的结果表明，流体流变学在塑造QS调控的生物发光中起决定性作用。在牛顿流体中，发光强度随黏度呈非单调依赖，而在黏弹性的Methocel溶液中则单调下降。单细胞追踪表明，增加的黏度提高了鞭毛包裹的概率并限制了游泳速度，在含Methocel的培养基中观察到更强的降低。与先前报道的大肠杆菌中黏度增强运动不同，费氏弧菌在剪切稀化介质中未显示速度增强，强调了物种特异性运动机制和鞭毛动力学的重要性。考虑到这是一个值得研究但并非当前工作主要焦点的现象，我们将在未来对费氏弧菌在黏弹性流体中速度降低行为进行详细的实验和理论研究。

重要的是，这些发现与费氏弧菌和夏威夷短尾乌贼的自然共生背景相呼应。在初始定植过程中，乌贼光器官表面的纤毛摆动捕获海水中的细菌，同时分泌已知具有非牛顿、黏弹性性质的黏液。先前的研究表明，细菌游泳速度过高或过低都会降低宿主捕获和保留效率[45,46]。我们观察到的费氏弧菌在非牛顿流体中经历显著的运动减缓，因此与这种生态限制相一致，表明流体流变学可能作为物理调节剂，在宿主介导的选择和积累过程中调节细菌传输。

通过量化游泳速度、转向角和运动模式比例，我们推导出表征细胞探索环境效率的有效扩散系数。我们表明，该扩散系数随黏度的变化一致地预测了在牛顿和非牛顿流体中观察到的发光强度变化。基于扩散的细胞和信号分子相互作用模型进一步重现了实验趋势，突出了“搜索效率”作为连接流体动力传输与集体生化激活的关键物理控制参数。

本研究有几个局限性需要承认。有效扩散描述分离了细菌传输对信号相遇的物理贡献，并不代表完整的生化QS过程。特别是，当前模型没有明确考虑时间依赖的信号产生和降解、细胞内LuxI/LuxR反馈、QS激活与运动之间的生化耦合，或信号产生的异质性。因此，有效扩散应被视为调节QS激活的一个物理因素，而非其唯一决定因素。未来工作可以通过将细胞内QS调控与运动动力学耦合、探索单鞭毛尺度下的近场黏弹性效应，以及将框架扩展到更高细胞密度或结构化环境来解决这些局限性。探索流体流变学如何调节其他运动细菌中的QS，可能进一步揭示控制微生物通讯的一般物理原理。

IV. 材料与方法

A. 细胞培养

实验中使用的费氏弧菌细胞（菌株CICC24882）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。细胞在250 ml带透气膜的锥形瓶中培养于海洋肉汤2216E中，透气膜允许充分气体交换同时最小化外部干扰。培养物维持在 。细胞首先在海洋肉汤2216E中培养约24小时，然后以1:500稀释到新鲜培养基中，再额外培养6–8小时进行实验。在此阶段，细胞表现出稳定的游泳行为和高活力，确保一致的实验条件。

B. 样品制备

培养后，费氏弧菌细胞轻轻转移到TMN运动缓冲液（基于Tris-HCl的缓冲液，含有NaCl、 和葡萄糖）中进行游泳行为观察。TMN提供定义明确的离子和能量环境，维持运动同时抑制测量过程中的失控生长（表I）。

表I. 每升TMN运动缓冲液的成分（ ）[32]。成分 化学式 每1 L含量 Tris-HCl缓冲液 – 50 mM 氯化钠 NaCl 17.5 g 氯化镁（无水） 0.48 g D-葡萄糖 0.90 g 去离子水 – 至1 L

对于涉及复杂流体的实验，根据实验目的，将PVP（ kDa）和/或Methocel（甲基纤维素）以指定浓度（表示为重量/体积百分比 % w/v）添加到TMN中。本研究中使用的PVP浓度为0%、0.21%、0.37%、0.50%和0.62% w/v，而Methocel浓度为0%、0.05%、0.10%、0.15%和0.17% w/v。加入聚合物后，溶液在轨道摇床上以200 rpm混合超过12小时，以确保聚合物完全溶解。

C. 生物发光成像装置

群体感应诱导的生物发光使用工业CMOS相机（型号MV-CU120-10UC）在连续采集模式下监测。图像采集和相机控制使用制造商提供的机器视觉软件（HIKROBOT MVS，版本4.5.1）进行。安装固定焦距镜头（MVL-HF0624M-10MP）以提供稳定的视野和高光收集效率。

所有测量均在暗室中进行，以消除背景光照。成像系统在整个实验过程中保持在恒定温度 ，以确保稳定的生理条件。延时图像以每分钟一帧的时间分辨率记录，能够连续追踪细菌生物发光的起始和时间演变。

细胞浓度随后通过在600 nm处的光密度测量（ ）进行定量。浓度校准后，将样品置于黑暗环境中，记录细菌群体发出的生物发光。通过延时成像监测生物发光，并将记录的图像转换为8位灰度格式，像素强度范围为0至255。平均灰度强度被用作生物发光输出的定量指标，以便在不同流体条件下进行一致比较。结果总结在补充材料[22]的图S6中。生物发光强度随细胞浓度的增加而单调增加，表明QS激活的光发射与群体密度之间存在明显的正相关关系。相反，发光信号的持续时间随细胞浓度的增加而减少。这种反向关系可能是由于高细胞密度下溶解氧的快速消耗，限制了生物发光反应的可持续性。D. 鞭毛剪切通过反复吸打从费氏弧菌细胞中机械去除鞭毛。简言之，用移液器（Eppendorf，10–200 ）吸取部分细菌悬浮液，然后从移液器尖端快速排出。重复此吸打循环50次，以剪切细菌细胞的鞭毛。补充材料[22]中的电影S7和S8提供了鞭毛剪切前后细菌细胞的比较。由于鞭毛去除是通过反复手动吸打进行的，施加的机械剪切力的微小变化可能导致不同批次间鞭毛去除程度和细胞残余运动性的差异。反复的机械处理也可能给细胞施加变化的机械应力，导致独立实验之间观察到的较大变异性。E. 3D实时追踪技术采用3D实时追踪技术长时间记录单个费氏弧菌的三维游动轨迹。使用配备PX.EDGE 5.5-sCMOS相机的倒置显微镜（型号Nikon ECLIPSE Ti2-U）观察细胞。使用二维位移台跟踪细胞在平行玻璃板方向上的运动。压电位移台（Pi）用于记录细胞在垂直方向上的运动并控制焦平面的位置，以确保细胞始终在视野中。通过用 语言编写的算法，以60帧/秒的速率获取300×300像素的图像。二维和压电位移台的数据同时记录。最终在指定时间内获得细胞的实时三维运动轨迹。如图3(b)所示，每个细胞连续追踪10秒，从而清晰分辨出每个细胞的整个推/拉-包裹-推/拉游动周期。在游泳模式识别之前，对三维轨迹进行平滑处理以减少测量噪声。瞬时游泳方向由连续帧之间的位移矢量确定，游泳方向的变化由连续位移矢量之间的夹角计算。当连续两帧之间的方向变化超过 时，识别为包裹模式的开始。当细胞的瞬时游泳速度低于同一轨迹内最大游泳速度的30%时，认为细胞保持在包裹模式。每个包裹事件的持续时间由满足此速度标准的时间间隔确定。相反，轨迹段显示相对直线运动，方向变化低于 且游泳速度相对较高，被分类为推/拉模式。F. 基于扩散的相遇模拟在MATLAB中执行三维布朗动力学模拟，以量化运动的费氏弧菌细胞与自由扩散的信号分子之间的相遇。一个细菌和10000个信号分子最初均匀随机分布在边长为 的立方体域内。细菌的运动由实验确定的每种粘度和流体条件下的有效扩散系数 表示。信号分子的扩散系数 使用斯托克斯-爱因斯坦关系计算： ，其中 是玻尔兹曼常数， ， 是动力粘度。3-氧代-C6-HSL分子近似为密度与周围液体相当的球形颗粒。基于其分子量 ，其等效球半径估计为 ，并用作斯托克斯-爱因斯坦关系中的流体力学半径近似值[47]。模拟域的所有六个表面都应用反射边界条件。模拟以时间步长 进行，总时长为 。当细菌和信号分子之间的中心到中心距离小于或等于 时，记录一次相遇。每个信号分子仅计数一次，即使随后多次遇到细菌。细菌遇到的独特信号分子的平均数被用作信号搜索效率的量度。为了在不同流体条件下进行比较，平均相遇次数按粘度 下获得的值进行归一化。