比格犬出生后眼部发育的组织形态学与免疫组织化学特征研究

《Veterinary Pathology》：Postnatal ocular development in the beagle dog: A histomorphological and immunohistochemical study

　　

：比格犬是幼年毒性研究中常用的非啮齿类动物，支持儿科药物开发，也是眼科研究的相关模型。然而，出生后眼部发育的参考数据有限，这给未成熟组织的组织学发现解读带来困难，尤其是在缺乏年龄匹配对照组的情况下。本研究对68只比格犬从出生至6月龄、时间点密集采集的眼部进行了全面的组织学和免疫组织化学特征描述。出生时眼睑闭合，所有眼部结构均未成熟。主要发育事件主要发生在前2个月，包括眼睑睁开（约出生后第14天，PND14）前后的角膜上皮分层、玻璃体动脉和瞳孔膜血管残余的消退、多个结构的高增殖指数以及视网膜发生。值得注意的是，出生时视网膜仍含有胎儿期外神经母细胞层。组织学和免疫组织化学（视紫红质、突触素、胶质纤维酸性蛋白、Ki-67、钙结合蛋白、裂解型caspase-3和血管性血友病因子）显示，视网膜发生的关键阶段主要发生在出生后前3周，从视觉条带区域起始，并以中央至周边梯度进展——这与人类胎儿视网膜发育从黄斑中心凹/旁中心凹区域开始的过程相平行。大多数眼部结构在2至6月龄之间达到组织形态学成熟。这些数据为在幼年毒性研究中区分正常发育变化与受试物相关效应提供了必要参考，并增强了比格犬在儿科和眼科研究中的转化相关性。

论文解读

一、研究背景与意义

比格犬是幼年毒性研究中优选的非啮齿类动物，美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局等监管机构均认可幼年动物研究对于充分评估拟用于儿科人群药物安全性的重要性。幼年动物在出生时及出生后发育过程中正常存在的结构和功能未成熟状态，可显著影响外源化合物的毒代动力学和毒理学反应，这种影响未必能从成年动物模型中预测。例如，类固醇、抗生素、麻醉剂、抗抑郁药和抗癌药物等几类药物已被报道在幼年实验动物或儿童中引起眼部毒性，包括白内障、角膜病变和视网膜发育不良或空泡化，而成年个体中未见相应反应。此外，比格犬也被认为是人类眼科疾病研究和药物开发的相关模型，其与人类眼睛共享关键解剖学和组织学相似性，包括全血管性视网膜血管模式、可比的虹膜角膜角尺寸、相似的眼球大小，以及存在富含视锥光感受器的区域——视觉条带，该区域在一定程度上类似黄斑。然而，尽管幼年眼部病理学在毒理学和转化研究中均具有重要意义，犬发育中眼部组织的组织学评估仍具挑战性，因为许多眼部结构的出生后发育参考数据稀缺或完全缺失。

二、研究设计与技术方法

研究人员对68只比格犬（52只来自加拿大Charles River Laboratories，16只由美国Marshall BioResources捐赠）从出生至6月龄的多个时间点进行了系统研究，动物分布于PND0至PND180及成年组。采用矢状面沿中轴平面切片，包括视盘和视神经纵切面，进行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。免疫组织化学使用了7种标志物：裂解型caspase-3（凋亡）、突触素（视网膜突触和光感受器内节）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，视网膜胶质细胞）、视紫红质（视杆光感受器）、钙结合蛋白（水平细胞和无长突细胞）、血管性血友病因子（vWF，内皮细胞）和Ki-67（细胞增殖）。所有切片以40倍放大数字扫描，采用定性方法评估组织学和免疫组织化学结果。

三、研究结果

角膜：出生至PND7期间角膜上皮仅由1至罕见2层卵圆形上皮细胞构成，眼睑睁开前后上皮开始分层，至PND60时上皮达到成年形态，中央及周边7至8层，角膜缘4至6层。基质在出生时薄而细胞密集，含丰满角膜细胞，至PND180细胞密度降低并呈成年形态。内皮细胞密度随年龄下降并逐渐扁平化，约PND102时接近成年外观。Descemet膜厚度随年龄增长，至PND90约为出生时两倍并达到成年厚度。PND0至PND21期间角膜各区域上皮基底层和基底上层细胞频繁显示Ki-67免疫反应性。

晶状体：出生时晶状体囊极薄，至PND180增厚约7至8倍，但仍略薄于成年犬。前囊下上皮出生时为单层立方状，赤道前区为单层柱状。PND0至PND60期间赤道前区Ki-67阳性上皮细胞较后期更为丰富。晶状体上皮约在PND30时组织形态学上与成熟晶状体相当，此后变化主要反映纤维积累导致的体积增大。

虹膜角膜角：出生至PND4期间虹膜角膜角狭窄、浅表且细胞密度高于成年。睫状裂和角膜巩膜网之间的界限不清晰，小梁短且由丰满间充质细胞衬覆。角状房水丛和巩膜内静脉丛在出生时已明显且形态与成年结构相似。至约PND60，房角加深加宽，小梁变薄并获得扁平内皮衬覆，小梁间间隙增大，房角达到组织形态学成熟。

虹膜：出生时虹膜短而薄，所有亚结构均未成熟。后上皮顶端细胞为卵圆至立方状，黑色素颗粒少于成年。基底肌上皮层（瞳孔开大肌）薄而不连续。基质细胞密度高，含分化不良的间充质细胞和少量胶原。主要组织形态学变化发生在PND42之前，至PND90时虹膜类似成熟虹膜。PND1至PND30期间后上皮两层和基质中Ki-67阳性细胞频繁。

睫状体：出生时主要突起被平坦的突起间谷分隔，无次级突起，扁平部比例较成年短。基底上皮层色素丰富，与成年相似。无色素上皮细胞在PND0时突触素免疫反应性极弱，至PND42逐渐增强至成年样细胞质/膜模式。纵行睫状肌出生时狭窄、细胞密集，含未成熟肌纤维和稀少肌浆，至PND60肌浆增加并呈成年样。PND0至PND60期间肌纤维Ki-67阳性频繁。

胎儿血管残余：玻璃体动脉残余在PND0至PND21期间偶见于玻璃体，主要靠近晶状体后极。晶状体血管膜毛细血管残余在出生时沿晶状体前、侧和后表面分布，消退首先发生于PND7前极，最后为PND21后极。瞳孔膜残余在PND0至PND30期间从前基质瞳孔缘延伸，至PND14前血管索横跨整个瞳孔孔径，PND21至30局限于瞳孔缘附近。玻璃体动脉和瞳孔膜残余中未检测到凋亡细胞，晶状体血管膜中偶见裂解型caspase-3阳性凋亡内皮细胞。

视网膜：出生时几乎所有区域的外视网膜由胎儿期外神经母细胞层（NBL）构成，而神经纤维层（NFL）、神经节细胞层（GCL）和内核层（IPL）已可区分。视觉条带在出生时即可识别，表现为视盘背侧神经节细胞密度较高区域。出生后视网膜发生遵循中央至周边有序进展，周边区域滞后中央约2至3周，视觉条带区域较中央腹侧领先约3天。外丛状层（OPL）在视觉条带区域出生时已呈微细不连续状，中央腹侧约PND3至4首次明显，PND14时延伸至睫状缘附近，PND21时连续并达到成年厚度。内核层（INL）核形态中央约PND14成熟，周边约PND21至30成熟。视杆光感受器核由卵圆未成熟形态转变为圆形成熟形态约在PND51至53完成。光感受器内节和外节首先在中央PND14出现，周边PND30出现，至PND42显著延长。视网膜血管系统方面，出生时未成熟浅层血管丛从视盘延伸至约视网膜中部，PND21时延伸至睫状缘，中间和深层血管丛首先在中央PND21出现，PND60时全视网膜三个血管丛呈成年模式。Ki-67阳性神经母细胞从出生至PND7在所有区域沿NBL或原始ONL外缘排列，PND14时中央INL和ONL中Ki-67免疫反应性消失，PND21至42仅睫状缘附近INL中偶见阳性细胞。裂解型caspase-3阳性凋亡细胞在PND0至14期间见于NBL前部或新形成INL，PND0至21期间见于GCL和/或NFL。PND21至成年，GCL非神经节细胞、INL内层和中层及RPE中可见非凋亡性裂解型caspase-3核免疫反应性。

视神经：出生时视神经含髓鞘纤维，细胞密度高于成年，筛板胶原板层和间隔发育不良。视神经细胞密度至PND102时呈成年样。PND1至30期间可见大量Ki-67阳性细胞，PND42至180及成年期仍有少量散在阳性细胞。

脉络膜和巩膜：出生时脉络膜总体架构类似成年且有色素沉着，但基质成纤维细胞和内皮细胞丰满，透明膜细胞密集、核大而胞浆稀少。PND0至42期间基质和透明膜细胞Ki-67阳性频繁。巩膜出生时显著薄、细胞密集，含丰满成纤维细胞，主要变化发生在PND51之前。

四、讨论与结论

本研究表明，比格犬出生后眼部发育与其他非临床和家养物种及人类共享关键特征，包括视网膜神经元和胶质细胞增殖与分化的中央至周边梯度、通过凋亡进行的生理性神经元修剪、与眼睑睁开同步的角膜上皮分层、玻璃体血管的前至后消退，以及晶状体去核不涉及caspase-3激活。尽管事件序列保守，但各物种间时间差异显著，主要取决于眼睑分离的时间。比格犬与啮齿类动物相似，眼睑在出生后约2周才睁开，新生犬眼的发育阶段较眼睑在出生前或出生时即张开的物种（如人类和猪）延迟。新生比格犬眼前段形态与人类胎儿约20至24孕周相当，而中央视网膜与人类胎儿约15孕周接近。视网膜发生从视觉条带起始并向周边扩展的模式与人类胎儿视网膜从黄斑中心凹/旁中心凹区域开始发育的空间进程相平行。视紫红质免疫反应性在视杆细胞体中的短暂表达遵循中央至周边出现和消退模式，与细胞周期退出和分化进程一致。这些数据为幼年毒性研究中区分正常发育变化与受试物相关效应提供了关键参考，并增强了比格犬在儿科和眼科研究中的转化相关性。