《Frontiers in Endocrinology》：Twelve novel Italian cases of hypophosphatasia: challenging cases with an extremely variable phenotype
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背景： 低磷酸酯酶症是一种先天性骨代谢错误，影响肌肉骨骼和神经系统。它由编码组织非特异性碱性磷酸酶的 ALPL 基因的单等位或双等位致病变异引起。鉴于其从产前表现到成年晚期症状发作的显著临床变异性，低磷酸酯酶症常常未被发现，可能对患者造成潜在危害。
方法： 研
背景： 低磷酸酯酶症是一种先天性骨代谢错误，影响肌肉骨骼和神经系统。它由编码组织非特异性碱性磷酸酶的 ALPL 基因的单等位或双等位致病变异引起。鉴于其从产前表现到成年晚期症状发作的显著临床变异性，低磷酸酯酶症常常未被发现，可能对患者造成潜在危害。
方法： 研究人员对12名具有不同临床表现的低磷酸酯酶症患者进行了临床、分子、计算机模拟、体外研究，并在可行时进行了家系研究。根据美国医学遗传学与基因组学学会的建议对变异进行分类。
结果： 四例诊断为婴儿型，一例为成人型低磷酸酯酶症。其他病例完全无症状（4例）或表现出并非严格与低磷酸酯酶症相关的症状（3例），但均基于生化指标（低ALP值）或严重的骨脆性表型而被偶然发现。共鉴定出12种“致病性或可能致病性变异”，包括9个错义突变（1个新发，8个既往报道）、2个框内插入缺失和1个多外显子缺失。对七种尚无功能性数据描述的点突变的体外表征证实，某些突变酶的酶活性显著降低。
结论： 提高对低磷酸酯酶症的认识至关重要，因为其罕见性和极端多变的临床表现（伴有许多无症状病例）常导致误诊或延迟诊断。增强临床警觉性并持续关注低ALP水平对于实现更早、更准确的诊断至关重要。
研究背景与目的
低磷酸酯酶症（HPP）是一种罕见的遗传性骨代谢疾病，主要影响肌肉骨骼和神经系统。该病由编码组织非特异性碱性磷酸酶（TNSALP）的 ALPL 基因发生单等位或双等位致病变异所引起。HPP的临床表现谱极为广泛，从致死性的围产期型到仅表现为牙齿异常的牙型低磷酸酯酶症，再到成年期才出现轻微症状的成人型。这种极端的临床异质性使得许多患者，尤其是症状轻微或无症状的个体，极易被漏诊或误诊。此外，高达80%的 ALPL 变异为意义未明的错义突变，加之遗传模式的复杂性（常染色体隐性 vs. 显性），给疾病的分子确诊带来了巨大挑战。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过对12例意大利新发HPP病例进行临床、分子、体外功能及计算机模拟等多层面的综合分析，深入探讨该病的临床异质性、分子病理机制，并评估现有诊断方法的效能，以提高对该病的识别能力。
研究方法与关键技术
研究人员招募了来自意大利北部、中部、南部和撒丁岛多个三级医疗中心的12名患者。入组标准为至少两次检测的血浆碱性磷酸酶（ALP）活性低于正常范围下限。采用新一代测序技术对患者DNA进行测序，并对发现的变异根据美国医学遗传学与基因组学学会指南进行分类。对于7个缺乏功能数据的点突变，研究人员通过蛋白质免疫印迹法检测突变蛋白的表达水平，并使用比色法测定其残余酶活性。同时，利用计算机模拟三维结构预测工具（如Missense3D和FoldX）评估氨基酸替换对蛋白质结构和稳定性的影响。对于部分家系，还进行了家系共分离分析。
研究结果
患者临床特征
研究纳入了12名患者。其中4名患者（#9至#12）在成年后因典型的HPP症状（如多发性骨折、骨痛、缺齿）和持续低ALP水平而确诊。另外4名患者（#1至#4）几乎完全无症状，仅因体检偶然发现低ALP而最终通过基因检测确诊。还有3名患者（#5至#7）表现出与HPP不典型的相关症状，如脊柱关节炎、生长迟缓或神经运动发育延迟。特别值得注意的是患者#8，他表现出严重的骨脆性表型（疑似成骨不全症），但其ALP水平却正常，最终通过针对骨脆性相关基因的靶向测序发现了 ALPL 致病性变异。
NGS和MLPA检测结果
在所有12名患者中，研究人员共鉴定出12种杂合致病变异，包括9个错义突变、2个框内缺失和1个大片段缺失。其中，p.(Pro174Leu) 和大片段缺失为首次报道的新变异。根据ACMG指南，所有变异均被归类为“可能致病性”或“致病性”。家系分析显示，一些无症状患者的亲属也携带相同变异，但同样无明显临床症状。
差异条带的蛋白表达
免疫印迹结果显示，除p.(Pro174Leu)突变体蛋白表达水平与野生型相当外，其余所有测试的突变体（如p.Gly491Arg、p.Asn440del、p.Arg272His、p.Thr167Met）的66 kDa和88 kDa糖基化形式的表达量均显著下降，部分甚至几乎无法检测到。
酶活性测定
比色法测定残余酶活性（REA）的结果表明，所有突变体的酶活性均显著降低。其中，p.(Arg272His)保留了约30%的活性，p.(Gly491Arg)保留了约50%的活性，而其余突变体（如p.Glu84Lys、p.Pro307Leu、p.Thr167Met、p.Phe328del、p.Asn440del、p.Pro174Leu）的酶活性几乎完全丧失，与阴性对照组相当。
三维结构预测
计算机模拟分析显示，Missense3D预测p.(Gly491Arg)为“有害性”突变，因其位于一个结构转角处。而FoldX热力学稳定性分析则指出，p.(Pro307Leu)、p.(Arg272His)和p.(Pro174Leu)具有显著的失稳效应，这与它们极低的体外酶活性和表达水平一致。这两种方法互为补充，共同揭示了不同突变对蛋白质结构和稳定性的差异化影响。
讨论与结论
讨论
本研究报告了12例由杂合 ALPL 致病变异引起的HPP新病例。研究发现，即使在具有典型临床症状的患者中，从发病到确诊的平均延误时间也长达数十年，凸显了提升疾病认知的紧迫性。对于无症状或非典型患者，持续的血清低ALP水平是启动基因检测的关键线索。然而，案例#8的存在（严重表型但ALP正常）进一步复杂化了临床诊断路径。研究人员发现，尽管一些突变（如p.Glu84Lys、p.Pro307Leu）在体外功能实验中显示出几乎完全的酶活性丧失，但在携带者中并未引发明显的临床症状。这提示可能存在尚未明确的生理补偿机制，或者这些杂合变异本身不具备显性负效应，仅表现为生化水平的异常。相反，对于p.Gly491Arg突变，其保留了约50%的残余酶活性，却与较严重的临床表现相关，这种不一致性值得进一步探究。研究还强调，对于仅表现为低ALP血症的“亚临床HPP”个体，应提供遗传咨询并进行严密随访，同时避免使用抗骨吸收药物作为预防措施。
结论
本研究扩大了无症状HPP患者的数量，表明这种情况可能比预期的更为常见。这强调了采用多学科方法并加深对HPP相关病理学的理解以实现快速诊断的必要性。研究还扩展了对 ALPL 变异如何影响蛋白质结构和酶功能的认识。尽管仍需进一步的分子研究来充分解释为何某些突变在造成明确的功能损伤后仍不产生临床症状，但可以肯定的是，随着全外显子组测序在临床中的广泛应用，将有更多携带 ALPL 变异的个体被发现。获取这些个体的生化和临床数据将极大地促进我们对疾病病理生理学及其从单纯生化异常进展为全面临床表现的理解。
