细胞死亡相关炎症重塑框架下的SPP1/KRT5轴：高级别浆液性卵巢癌多组学、单细胞与照射验证

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Cell-death-associated inflammatory remodeling of the SPP1/KRT5 axis in high-grade serous ovarian cancer: multi-omics, single-cell, and irradiation validation

　　

背景：高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）以广泛的细胞异质性和频繁出现化疗耐药为特征。治疗诱导的细胞损伤和调控性细胞死亡（RCD）可重塑炎症信号和肿瘤微环境（TME），但死亡相关应激反应与表达分泌型磷蛋白1（SPP1/osteopontin）的髓系细胞或角蛋白5（KRT5）阳性上皮状态之间的关系仍未完全明确。方法：对癌症基因组图谱卵巢癌（TCGA-OV）429例肿瘤样本的原始RNA-seq计数和临床注释进行分析。GSE165897的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据包括来自11例转移性HGSOC患者的22个配对治疗初治和NACT后（post-NACT）文库（51,786个细胞）。GSE316118提供KRT5⁺和KRT5^? SKOV3群体的RNA-seq谱（每组n = 3）。进行差异表达、通路富集、程序评分、配对样本水平比较和跨层一致性分析。此外，SK-OV-3细胞暴露于0或6 Gy X射线照射，并通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）定量SPP1、HIF1A、VEGFA和KRT5。RCD被作为机制背景处理，而非直接由转录组数据判定。结果：在TCGA-OV中，SPP1表达与炎症程序相关性最强（Spearman r = 0.63），与缺氧（r = 0.42）和上皮-间质转化（EMT）（r = 0.35）呈较弱正相关；SPP1高表达组与SPP1低表达组的总生存期无显著差异（log-rank P = 0.181）。在单细胞分辨率，SPP1主要定位于髓系区室，而KRT5表达局限于上皮细胞亚群。NACT后，上皮VIM表达和上皮缺氧程序显著增加，而髓系SPP1呈非显著下降趋势。在SKOV3数据集中，KRT5⁺和KRT5^?群体显示互为探索性的KRT5-癌症增殖细胞（CPC）和SPP1-生态位（niche）特征。TCGA-OV中观察到的SPP1-炎症正偶联在独立单细胞队列的样本水平得到重现（r = 0.71）。在受照射SK-OV-3细胞中，SPP1、HIF1A、VEGFA和KRT5在24 h显著增加（均P < 0.01）。总之，这些发现与细胞损伤/死亡背景下的治疗相关炎症重塑一致，但未确立特定细胞死亡模式。结论：这些数据确定SPP1标记的髓系炎症和KRT5相关上皮状态是转移性HGSOC的互补特征，并支持将治疗应激与上皮缺氧/间质程序联系起来的细胞死亡相关炎症重塑框架。这些发现是关联性和假设生成性的；特定RCD通路需要直接功能验证。

HGSOC占卵巢癌死亡的大多数，常于晚期诊断；尽管细胞减灭术和铂类-紫杉烷化疗可产生显著初始反应，复发和获得性化疗耐药仍是治疗失败的主要原因。肿瘤分子异质性和TME复杂性使稳定生物标志物及治疗相关细胞状态的识别困难。TME包含上皮、免疫、基质和内皮等相互作用区室；SPP1表达性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是跨癌种反复出现的炎症和免疫调节状态，并与卵巢癌SPP1-CD44轴相关；HGSOC中KRT5⁺癌症增殖细胞（CPC）和产生骨桥蛋白的KRT5^?生态位（niche）提供了考察KRT5相关上皮状态与SPP1相关微环境程序关系的框架。RCD可通过凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡等连接治疗损伤与炎症组织重塑，裂解性或免疫原性死亡可释放损伤相关分子模式（DAMPs）等应激信号，但转录组关联不能判定特定RCD模式。因此，研究人员整合TCGA-OV bulk转录组、GSE165897配对单细胞谱和GSE316118 KRT5分选SKOV3数据，并以照射SK-OV-3细胞作正交应激验证，旨在定义SPP1相关全转录组程序、定位SPP1/KRT5相关状态、量化NACT前后样本水平变化、比较KRT5⁺/KRT5^?细胞状态轴，并在细胞死亡相关炎症重塑框架内解释SPP1/KRT5轴及治疗相关缺氧/EMT程序。该研究意义在于提出关联性、假设生成性的跨层框架，将治疗相关细胞损伤/死亡背景与髓系炎症及上皮应激状态联系起来，但不建立特定死亡模式或因果机制。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员分析TCGA-OV 429例肿瘤（421原发、8复发）bulk RNA-seq；使用GSE165897中11例转移性HGSOC患者的22个配对治疗前/后NACT单细胞文库（51,786个细胞）；使用GSE316118中KRT5⁺与KRT5^? SKOV3群体RNA-seq（每组n = 3）。开展差异表达、通路富集、程序评分、样本水平配对比较及跨层一致性分析；并将SK-OV-3细胞行0或6 Gy X射线照射，24 h后RT-qPCR检测SPP1、HIF1A、VEGFA和KRT5。RCD仅作解释背景，不由转录组直接判定。

研究结果：3.1 SPP1在TCGA-OV队列中标记炎症程序：对429例bulk样本分析显示，SPP1与炎症程序强相关（r = 0.63），与缺氧（r = 0.42）和EMT（r = 0.35）弱相关，与KRT5 CPC程序无关（r = ?0.03）；SPP1高/低表达组总生存期（OS）无显著差异（log-rank P = 0.181）。3.2 Bulk肿瘤中全转录组SPP1相关程序：DESeq2比较SPP1高/低表达组发现319个上调、494个下调基因，MMP9和CD44为重要共调控基因；GSEA显示炎症和免疫Hallmark程序富集，GO分析以髓系和炎症词条为主；沿SPP1表达梯度炎症程序紧密跟随，EMT和缺氧向高表达端升高；SPP1表达不随FIGO（国际妇产科联盟）分期变化，而KRT5 CPC和SPP1生态位程序在分期间有差异。3.3 配对NACT前后转移性HGSOC单细胞图谱：22个文库质控后构建图谱，UMAP重现EOC、基质和免疫三区室，标记细化出9个主要谱系；治疗初治与NACT后细胞在共享嵌入中混合，提示差异为渐变而非批次样。3.4 转移微环境注释与组成：各谱系呈预期标志物模式，T细胞、上皮性卵巢癌细胞（EOC）和成纤维细胞占主导；NACT后T细胞和NK细胞比例呈上升趋势、EOC变化异质，均未达配对显著；巨噬细胞仍为最大髓系群体；EOC细胞UMI和检测基因数最高，标志物矩阵无交叉反应。3.5 单细胞分辨率SPP1/KRT5轴：SPP1主要位于髓系富集区（占全部细胞13.6%），KRT5限于上皮亚群（7.1%）；SKOV3来源KRT5 CPC程序在髓系评分最高、EOC最低，提示该细胞系来源程序在患者肿瘤中受髓系表达基因主导，而KRT5本身仍上皮限制；髓系贡献59%的SPP1⁺细胞，62%髓系细胞表达SPP1；EOC_C7具最高KRT5表达和最高EMT评分，EOC_C6 KRT5次之，被提名为KRT5⁺ CPC候选。3.6 NACT后微环境重塑：样本水平显示髓系SPP1下降趋势（P = 0.102），EOC VIM显著增加（P = 0.00293）；EOC pseudobulk无基因通过全转录组FDR校正；EOC缺氧程序显著增加（P = 0.000977），KRT5 CPC和SPP1生态位程序小幅增加（P = 0.0186和P = 0.0244），髓系炎症程序下降趋势（P = 0.083）。3.7 SKOV3分选群KRT5⁺/^?生态位模型：6个文库PCA显示KRT5⁺与KRT5^?群体重叠、差异温和，13个基因FDR显著；SPP1在KRT5^?生态位分数中趋势更高（log₂FC = ?0.74，名义P = 0.11）；KRT5 CPC与SPP1生态位程序呈互斥富集，但因其由同一对比定义，不构成独立验证；无KEGG词条通过校正P < 0.05。3.8 细胞死亡相关炎症重塑跨层整合：SKOV3 KRT5⁺/^?对比与scRNA NACT后EOC对比的基因效应几乎不相关（Spearman r = ?0.027），提示细胞身份与治疗重塑为不同生物学轴；候选基因效应呈层特异性，EOC NACT后效应温和且方向异质；Cox模型未显示SPP1或程序与OS在名义5%水平相关；TCGA-OV中SPP1-炎症正偶联在独立scRNA队列样本水平重现（r = 0.71，n = 22）；跨层总结显示SPP1-炎症强正偶联及EOC缺氧和VIM的NACT后显著增加，而髓系SPP1和T/NK比例变化不显著。3.9 体外照射验证：6 Gy组较0 Gy组24 h时SPP1（2.31倍）、HIF1A（2.18倍）、VEGFA（2.47倍）和KRT5（2.05倍）平均表达显著升高（均P < 0.01），支持急性照射相关转录应激反应，但未识别特定RCD模式。

讨论总结：该研究整合三层转录组和照射体外验证，显示SPP1在TCGA-OV追踪炎症程序、在配对单细胞中主要定位于髓系，并在独立bulk与单细胞数据中保持与炎症活动的正偶联；KRT5表达限于上皮，NACT后重塑最清晰表现为上皮VIM和缺氧程序增加，而非所有谱系一致变化；照射增加SPP1、HIF1A、VEGFA和KRT5，提供正交应激验证层。就细胞死亡而言，化疗和电离辐射可涉及多种RCD，但现有数据集无法分类这些模式，结果更适于解释为支持死亡相关炎症重塑模型，而非证明特定死亡通路。SPP1不能作为独立预后标志：TCGA中位分割无显著OS差异，单变量Cox模型亦未达名义5%显著。配对GSE165897分析提示化疗相关重塑具谱系特异性，上皮VIM和缺氧程序升高而髓系SPP1仅非显著下降；观察性分析不能推断直接调控，可能反映共享治疗相关上游程序。KRT5分选SKOV3数据提供独立细胞状态轴，KRT5_CPC_UP与SPP1_NICHE_UP互斥富集由同一对比定义，不构成独立验证；患者单细胞中KRT5仍上皮限制，但细胞系来源KRT5程序在髓系评分最高，提示跨区室基因影响。跨层比较反对将不同数据集合并为单一复合生物学轴，支持选择性使用跨层一致性。转化意义应谨慎：数据提名SPP1相关髓系炎症、KRT5相关上皮异质性和缺氧相关应激反应为治疗损伤、细胞死亡相关信号和TME重塑界面特征，但未建立直接调控、特定死亡模式、治疗敏感性或疗效；需功能扰动、死亡通路执行和DAMP释放直接测量、独立患者队列及空间或纵向验证。局限包括TCGA-OV为横断面bulk队列，配对scRNA-seq仅单公共数据集11例，GSE316118仅每组3例且签名同源，三层数据未直接批次整合，基因和程序相关为关联性并可能源于共享上游状态，未直接测量RCD执行或DAMP释放，亦无遗传扰动或空间验证。结论翻译：通过整合TCGA-OV bulk转录组、配对NACT前后单细胞数据、KRT5分选SKOV3转录组和基于照射的RT-qPCR验证，该研究支持HGSOC中的细胞死亡相关炎症重塑框架。SPP1在bulk和单细胞背景下一致追踪炎症活动，而NACT后重塑最清晰地表现为上皮缺氧和VIM表达增加；照射进一步在体外诱导SPP1、HIF1A、VEGFA和KRT5。KRT5⁺/KRT5^?轴捕获了独立的探索性细胞状态对比，而非同一治疗反应过程。总之，这些发现将治疗相关细胞损伤/死亡的生物学背景与髓系炎症和上皮应激状态联系起来，但未确立任何特定RCD模式；需直接测量死亡执行和DAMP释放以机制性检验该框架。