乌珠穆沁羊ABCD4 cDNA序列克隆、分子特征解析、重组蛋白表达及多克隆抗体制备研究

《Frontiers in Veterinary Science》：Cloning and molecular characterization of an ovine ABCD4 cDNA sequence, recombinant protein expression, and polyclonal antibody generation in Ujimqin sheep

　　

： 引言： ATP结合盒转运蛋白D亚家族成员4（ABCD4）是一种参与细胞内钴胺素转运的ATP结合盒转运蛋白，同时已被鉴定为与家畜椎骨数变异相关的候选基因。然而，绵羊ABCD4的分子信息和实验资源仍然有限。本研究旨在鉴定乌珠穆沁羊经cDNA末端快速扩增（RACE）获得的ABCD4 cDNA序列，分析其序列及预测的分子特征，建立重组蛋白表达系统，并制备多克隆抗体资源，以供后续研究使用。 方法： 研究人员从乌珠穆沁羊肝脏中提取总RNA，进行cDNA末端快速扩增（RACE），随后进行序列分析、系统发育比较、理化性质表征、在大肠杆菌中的重组表达、蛋白纯化及抗体制备。 结果： 获得了一条1,874 bp的ABCD4 cDNA序列，包含一个预测长度为1,209 bp的开放阅读框，编码402个氨基酸的多肽。序列及生物信息学分析表明，该RACE来源的序列保留了ABC转运蛋白家族的保守特征，但其预测蛋白长度短于典型的哺乳动物ABCD4蛋白。在重组抗原生产中，将ABCD4表达构建体导入大肠杆菌BL21（DE3），在37 °C下以0.5 mM IPTG诱导4 h后观察到较高的重组蛋白表达水平。重组蛋白主要存在于不溶性组分中，并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。随后，纯化的重组蛋白仅用于免疫新西兰白兔以制备多克隆抗血清，所得抗血清对重组抗原表现出强烈的免疫反应性。 讨论： 总体而言，本研究提供了RACE来源的绵羊ABCD4 cDNA序列以及重组蛋白和抗体资源，可为未来研究ABCD4在绵羊中的表达、定位及生物学功能提供支持。

论文解读文章

一、研究背景与意义

ATP结合盒转运蛋白D亚家族成员4（ABCD4）隶属于ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族，该家族成员通过水解ATP驱动多种底物的跨膜转运。典型的全尺寸ABC转运蛋白通常包含两个跨膜结构域（TMDs）和两个核苷酸结合结构域（NBDs），而哺乳动物ABCD蛋白属于半转运蛋白，每个单体含有一个TMD和一个NBD，以二聚体形式发挥功能。哺乳动物ABCD亚家族包含ABCD1至ABCD4，其中ABCD1-3主要定位于过氧化物酶体膜，参与脂肪酸酰基底物向过氧化物酶体的转运；而ABCD4在亚细胞定位和转运方向上均有显著差异，其主要定位于溶酶体膜，介导钴胺素从溶酶体腔向细胞质的输出，其溶酶体靶向依赖于LMBD1介导的从内质网到溶酶体的转运。结构上，全长ABCD4原体包含六螺旋跨膜结构域和含有高度保守ABC转运蛋白基序的胞质核苷酸结合结构域，两个原体结合形成具有两个TMD和两个NBD的功能性转运蛋白。功能上，与转钴胺素结合的循环钴胺素通过CD320介导的内吞作用被内化并递送至溶酶体，游离钴胺素由ABCD4输出，随后转化为甲钴胺素和腺苷钴胺素，分别作为甲硫氨酸合酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶的活性辅因子。因此，ABCD4功能缺失突变会损害溶酶体钴胺素输出，导致甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸尿症cblJ型，这是一种常染色体隐性遗传的细胞内维生素B12代谢障碍疾病，可表现为肌张力低下、发育迟缓、骨髓抑制、贫血和嗜睡等症状。

近年来，全基因组关联研究（GWAS）和群体遗传学分析在家畜重要经济性状相关基因的鉴定方面取得了显著进展。其中，ABCD4已被证明是与某些经济性状相关的候选基因，包括椎骨数变异。例如，在北京黑猪和乌珠穆沁羊中的GWAS分别将ABCD4鉴定为影响肋骨数和椎骨数的关键基因。然而，绵羊ABCD4的分子特征、转录本结构和理化性质在很大程度上仍未得到表征。因此，本研究旨在从乌珠穆沁羊中克隆并鉴定ABCD4 cDNA序列，分析其序列和预测的分子特征，建立重组蛋白表达系统，并制备多克隆抗血清，为后续研究提供分子和免疫学资源。

二、主要技术方法

研究人员从乌珠穆沁羊肝脏组织中提取总RNA，采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分别进行5′和3′ RACE扩增，获得ABCD4 cDNA序列。随后利用Contig Express、DNAMAN、MEGA 11.0等生物信息学软件进行序列组装、多序列比对和系统发育分析，并通过NCBI保守结构域数据库（CDD）、ExPASy服务器（包括ProtParam、ProtScale和SOPMA）以及SWISS-MODEL服务器进行保守结构域鉴定、理化性质分析、疏水性分析、二级结构和三级结构预测。在重组表达方面，将ABCD4编码序列克隆至pET-30a(+)载体并转化大肠杆菌BL21（DE3），通过IPTG诱导表达，采用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。最后，使用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，并通过间接ELISA和Western blot进行抗体效价和免疫反应性评估。

三、研究结果

3.1 RACE扩增及绵羊ABCD4 cDNA序列特征

从羔羊肝脏提取的总RNA具有较高的纯度和完整性。5′ RACE扩增获得单一主要产物，而3′ RACE产生三个不同长度的产物。序列比较显示，产物1和产物2具有相同的预测编码序列，而产物3在预测终止密码子上游发生分歧。从相同内部AUG翻译时，产物1和2预测编码402个氨基酸的多肽，产物3预测编码398个氨基酸的多肽。本研究获得的最长RACE来源cDNA序列为1,874 bp，开放阅读框分析鉴定出一个从第43位核苷酸延伸至第1,251位核苷酸的1,209 bp开放阅读框，编码402个氨基酸的多肽。与注释的绵羊ABCD4 RefSeq异构体X1（编码606个氨基酸蛋白）比较显示，该402个氨基酸序列对应XP_004010834.2的第205-606位残基，表明RACE来源序列缺少注释X1蛋白中N端的204个氨基酸，即5′编码区未被完全回收。因此，该1,874 bp序列被描述为RACE来源的绵羊ABCD4 cDNA序列而非全长转录本。

3.2 乌珠穆沁羊ABCD4蛋白的序列特征和生物信息学分析

保守结构域分析鉴定出N端ABC转运蛋白膜相关区域（ABC_membrane_2；Pfam06472）位于预测的402个氨基酸多肽的第1-90位残基，以及一个高度显著的ABCD亚家族ATP结合盒结构域（ABCD_peroxisomal_ALDP；cd03223）位于第183-394位残基。多序列比对显示乌珠穆沁羊ABCD4蛋白的氨基酸序列和功能域在九个哺乳动物物种中高度保守。系统发育树显示绵羊ABCD4与山羊和牛的ABCD4聚为一支。理化性质分析表明，该预测多肽的分子量为45,283.04 Da，理论等电点（pI）为5.43，亮氨酸（Leu）是最丰富的氨基酸（57个残基，占14.2%），其次是丝氨酸（Ser）（33个残基，占8.2%），含有41个带正电荷和50个带负电荷的氨基酸残基。二级结构预测显示该蛋白主要由α-螺旋（49.25%）和无规卷曲（31.09%）组成，平均疏水性为0.092，表明该蛋白为中等疏水性。SWISS-MODEL同源建模选择与乌珠穆沁羊ABCD4蛋白具有88.56%序列一致性的模板，生成的三维结构模型GMQE评分为0.85，QMEANDisCo评分为0.81 ± 0.05。

3.3 重组ABCD4蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

双酶切验证和测序确认了重组质粒pET-30a-ABCD4的成功构建。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导后在全细胞裂解液和不溶性组分中出现约37 kDa的明显目标蛋白条带。比较两种诱导条件，37 °C诱导4 h的蛋白表达水平高于15 °C诱导16 h。重组蛋白主要存在于包涵体组分中，以不溶性形式表达。基于表达效率和条带强度，选择37 °C诱导4 h作为最佳条件。包涵体经8 M尿素溶解后，通过Ni-NTA亲和层析纯化，SDS-PAGE显示获得高度纯化的His标签蛋白，约37 kDa。抗His单克隆抗体的Western blot检测到约37 kDa的明显免疫反应条带。值得注意的是，N端His标签重组蛋白的计算分子量约为46 kDa，与其表观电泳分子量存在差异。

3.4 抗ABCD4多克隆抗体的制备和效价评估

经过四轮免疫后，通过间接ELISA评估抗体反应。终放血后收集的抗血清中，兔A和兔B的终点效价分别为1:64,000和1:256,000。抗体纯化后，抗体A的终点效价≥1:512,000，抗体B的终点效价为1:256,000。这些结果表明抗体制品对重组抗原具有强烈的免疫反应性。绵羊肝脏蛋白的Western blot分析检测到约37 kDa的主要免疫反应条带。

四、讨论与结论

讨论部分指出，尽管ABCD4在人类和小鼠中已被充分表征，但在绵羊等经济动物中的分子和结构特征缺乏深入探索。既往GWAS和群体遗传学研究已将ABCD4鉴定为与猪和乌珠穆沁羊肋骨数和椎骨数变异相关的候选基因，但ABCD4作为参与细胞内钴胺素转运的膜转运蛋白，其转运功能与骨骼或椎骨发育之间的机制关系仍不清楚。因此，这些遗传关联应被解释为支持ABCD4作为候选基因座的证据，而非ABCD4调控椎骨数变异的直接证明。本研究未直接研究骨骼表型，也未建立ABCD4与椎骨发育之间的因果关系。此外，虽然选择肝脏作为RNA来源是因为公开表达信息显示该组织中ABCD4表达相对较高，但肝脏并不能直接代表椎骨或骨骼发育，因此本研究无法确定ABCD4在骨骼发育相关组织中的表达模式或功能作用。关于重组蛋白的分子量差异，计算分子量约为46 kDa，而SDS-PAGE和抗His Western blot一致显示表观分子量约为37 kDa，这种差异的原因尚不清楚，可能涉及异常电泳迁移、蛋白水解降解或重组表达过程中的截短。同样，绵羊肝脏中检测到的约37-40 kDa免疫反应条带不能仅凭现有Western blot分析确定性地归因于内源ABCD4，需要肽段竞争、基因敲除或质谱鉴定等额外正交验证。多克隆抗体的效价在第三次免疫后显著增加，在第四次免疫后达到峰值，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。

结论部分总结，本研究利用RACE技术从乌珠穆沁羊中鉴定了一条绵羊ABCD4 cDNA序列，在大肠杆菌中建立了绵羊ABCD4的重组表达和纯化体系，并制备了针对重组抗原的兔多克隆抗血清。这些分子和免疫学资源为未来研究ABCD4在绵羊中的表达、定位和生物学功能奠定了基础。