关山樱花及其活性成分通过抑制RAGE/NF-κB通路和恢复细胞外基质缓解甲基乙二醛诱导的皮肤成纤维细胞衰老

《Frontiers in Nutrition》：Kanzan cherry blossom and its active compounds attenuate methylglyoxal-induced skin fibroblast senescence through RAGE/NF-κB suppression and ECM restoration

　　

摘要 引言： 晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）的积累是皮肤衰老的关键驱动因素，通过氧化应激、炎症反应和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）稳态失衡加速这一过程。关山樱花（Cerasus serrulata 'Sekiyama' Kanzan cherry blossom, KCB）富含具有抗氧化和抗糖化潜力的生物活性化合物。然而，其不同花期成分组成的变化及其功能相关性尚不清楚。 方法： 本研究利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）系统表征了KCB的化学成分，并通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）监测了四个花期六种主要活性成分的动态变化。研究人员评估了所鉴定化合物的抗糖化、抗氧化、酪氨酸酶和胶原酶活性。进一步在甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）诱导的人皮肤成纤维细胞衰老模型中研究了KCB提取物（KCBE）及主要活性化合物的保护作用。 结果： 共鉴定出13种化合物，包括1种有机酸、5种黄酮苷和7种酚酸。半开期（KCB3）含有最高水平的六种定量化合物。1-O-咖啡酰葡萄糖苷（CG）是主要的酚酸（8.025 ± 0.203%），而槲皮素3-O-6″-O-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷（QMG）是主要的黄酮类化合物（1.155 ± 0.035%）。QMG表现出强的抗糖化活性（半数抑制浓度IC50 = 0.41 ± 0.01 mM），而CG表现出强的酪氨酸酶抑制（IC50 = 0.19 ± 0.03 mM）和胶原酶抑制活性（IC50 = 2.51 ± 0.90 mM）。KCBE、QMG和CG显著减轻了MGO诱导的细胞衰老，降低了细胞内活性氧（ROS），恢复了F-肌动蛋白组织，并促进了I型胶原沉积。这些效应与抑制RAGE/NF-κB信号通路、正常化Nrf2/HO-1介导的抗氧化反应以及恢复ECM相关基因表达有关。 讨论： 半开期的KCB展现出突出的抗糖化和抗皮肤衰老活性，其中CG和QMG是主要的生物活性成分。这些发现表明，KCB及其特征性的酚酸和黄酮类成分可能具有作为皮肤健康天然功能性成分的潜力。

论文解读

一、研究背景与研究目的

皮肤是人体最大的器官，主要由表皮和真皮构成。真皮层富含由人皮肤成纤维细胞（fibroblasts, Fbs）分泌的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分，包括胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸，它们共同维持皮肤的机械强度、弹性和水合度。持续的ECM重塑及其失调被认为是细胞衰老的关键标志之一。

糖化被认为是驱动皮肤衰老的主要机制之一。随着年龄增长和代谢压力增加，高反应性羰基化合物甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）在体内逐渐积累，促进非酶促糖化反应，导致晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）的形成。在皮肤微环境中，积累的AGEs与成纤维细胞上的AGEs受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）相互作用，触发过量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生并激活如核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）等炎症信号通路，从而促进成纤维细胞衰老。因此，寻找能够抑制糖化相关衰老的天然、安全、有效的植物源化合物已成为抗衰老产品开发的研究热点。

关山樱花（Cerasus serrulata 'Sekiyama', KCB）是一种具有观赏和食用价值的重瓣晚樱品种，含有黄酮类、多酚类等生物活性成分，具有较强的抗氧化活性。尽管KCB已被中国国家卫生健康委员会批准为新食品原料，但其生物活性成分的系统认知及潜在分子机制仍然有限，严重制约了其高价值产业化应用。本研究旨在系统鉴定KCB的化学成分，追踪其在四个花期的动态变化，筛选主要活性单体，并在MGO诱导的成纤维细胞衰老模型中验证其保护作用及分子机制。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）：用于对KCB乙醇提取物中的化学成分进行定性鉴定。
2. 2.
   超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）：采用多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）模式，对四个不同花期（花蕾期KCB1、初花期KCB2、半花期KCB3、盛花期KCB4）的KCB样品中六种目标化合物进行定量分析。
3. 3.
   体外酶活性和抗氧化测定：评估了KCB提取物（KCBE）及主要化合物的抗糖化、抗酪氨酸酶、抗胶原酶活性及铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）。
4. 4.
   细胞模型建立与检测：建立MGO诱导的人皮肤成纤维细胞（Fbs）衰老模型，通过CCK-8法测定细胞活力，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老表型，荧光染色观察F-肌动蛋白（F-actin）骨架和I型胶原（COL I）沉积，H₂DCFDA探针检测细胞内ROS水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子（IL-1β, IL-6, IL-8）分泌，实时荧光定量PCR（qPCR）检测ECM及衰老相关基因的mRNA表达水平。

三、研究结果

3.1 UPLC-QTOF-MS鉴定KCB中的化学成分

通过UPLC-QTOF-MS分析，从KCB中初步鉴定出13种化合物，包括1种有机酸（柠檬酸）、5种黄酮苷（芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-6″-O-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷QMG、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-6″-O-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷）和7种酚酸（新绿原酸、1-O-咖啡酰葡萄糖苷CG、绿原酸、1-O-香豆酰-β-D-葡萄糖苷及其异构体、1-O-阿魏酰葡萄糖苷、6-O-阿魏酰葡萄糖苷）。

3.2 不同花期KCB的UPLC-MS/MS定量分析

对四个花期的KCB进行定量分析，结果显示，六种目标化合物的总含量顺序为：KCB3 (10.076%) > KCB4 (9.471%) > KCB2 (8.902%) > KCB1 (6.825%)。其中，CG是含量最高的酚酸（在KCB3中达8.025%），QMG是含量最高的黄酮类化合物（在KCB1中最高，为1.491%）。因此，半花期（KCB3）被确定为最佳采收期，CG和QMG被选为主要活性单体进行后续研究。

3.3 KCBE及主要化合物的酶抑制和抗氧化效果

体外实验表明，黄酮类化合物（尤其是芦丁）表现出优异的抗糖化活性；酚酸类化合物（特别是CG和绿原酸）则表现出显著的酪氨酸酶和胶原酶抑制活性；所有测试化合物均呈浓度依赖性的抗氧化活性。这表明KCBE的多功能生物活性来源于酚酸和黄酮类成分的协同作用。

3.4 KCBE、QMG和CG对MGO诱导的Fbs衰老的保护作用

在MGO诱导的Fbs衰老模型中，KCBE（≤200 μg/ml）、QMG（≤20 μM）和CG（≤20 μM）处理显著降低了SA-β-gal阳性细胞的比例（QMG效果最强，降低74.1%），逆转了细胞肥大形态，并恢复了被破坏的F-肌动蛋白（F-actin）细胞骨架结构。

3.5 KCBE、QMG和CG对COL I沉积和细胞内ROS水平的影响

免疫荧光结果显示，KCBE、QMG和CG处理均显著增加了COL I的平均荧光强度（分别提高91.0%、94.8%和95.0%），表明它们有效减轻了糖化引起的ECM胶原损失。同时，三种处理均显著降低了细胞内ROS水平（分别降低76.0%、101.6%和109.7%），其中单体处理组的ROS水平甚至低于空白对照组。

3.6 KCBE、QMG和CG对MGO诱导的炎症反应的抑制作用

ELISA结果表明，MGO诱导显著提高了促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8的分泌水平。KCBE、QMG和CG处理均能显著抑制这三种细胞因子的分泌，其中KCBE将其分别降低了112.0%、135.9%和132.1%，使其恢复到低于正常水平。

3.7 KCBE、QMG和CG对ECM相关基因表达的调控

qPCR分析显示：

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  抑制RAGE/NF-κB信号通路：KCBE、QMG和CG均显著下调了RAGE、NF-κB和p65的mRNA表达水平，其中单体效果更优，将NF-κB和p65的表达恢复至接近或低于对照水平。
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  改善ECM重塑相关基因：三者均上调了COL I、COL III和赖氨酰氧化酶（LOX）的表达，同时显著下调了基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的表达，表明促进了胶原合成和交联，抑制了降解。
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  维持基底膜稳定性基因：三者均显著上调了层粘连蛋白亚基α3（LAMA3）和腓骨蛋白5（FBLN5）的表达，有助于维持基底膜完整性。
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  增强ECM结构和粘附基因：三者均上调了弹性蛋白（ELN）和纤连蛋白1（FN1）的表达，有利于维持ECM结构稳定。
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  促进透明质酸合成相关基因：三者均上调了透明质酸合酶1（HAS1）和透明质酸合酶2（HAS2）的表达，其中KCBE对HAS2的促进作用尤为显著，体现了多组分的协同效应。
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  调节抗氧化反应相关基因：MGO诱导后Nrf2和HO-1的表达代偿性升高，而KCBE、QMG和CG处理后其表达被下调，这反映了氧化应激得到缓解后，细胞抗氧化系统的反馈性正常化。

四、讨论与结论

讨论总结

研究表明，皮肤糖化相关衰老主要由AGEs的积累驱动，AGEs通过改变ECM结构并激活RAGE介导的信号通路，引发氧化应激和炎症级联反应，最终加速皮肤结构和功能的衰退。本研究中，UPLC-QTOF-MS揭示了KCB主要由黄酮苷和酚酸组成。动态定量分析确定半花期（KCB3）为目标化合物累积量最高的阶段，其中CG和QMG分别被确认为主要的酚酸和黄酮类活性单体。体外酶学实验证实了它们的多功能活性。在细胞层面，KCBE及其活性单体通过抑制RAGE/NF-κB信号通路、减轻氧化应激和炎症反应、恢复ECM相关基因表达等多重机制，有效缓解了MGO诱导的成纤维细胞衰老。研究也指出了局限性，如短期高浓度MGO诱导模型无法完全模拟人体皮肤中AGEs长期慢性积累的过程，未来需要在其他皮肤相关细胞类型及更贴近生理条件的模型中进行验证。

研究结论翻译

在本研究中，研究人员应用UPLC-QTOF-MS和UPLC-MS/MS技术对KCB的化学成分进行了系统的定性和定量分析。共鉴定出13种主要化合物，分为有机酸、黄酮类和酚酸类。植物化学分析显示，半花期（KCB3）的六种核心化合物累计含量最高，被确定为最佳采收窗口。其中，代表性酚酸CG占总目标成分的60%以上，而QMG被确定为主要的黄酮单体。

酶学和抗氧化实验表明，酚酸类化合物具有多功能的抗氧化、抗酪氨酸酶和抗胶原酶活性。相反，黄酮类化合物主要贡献于抗氧化和抗糖化能力。这两类化合物赋予了粗提物多功能的生物活性。此外，研究人员选择了KCBE及其特征性单体（QMG和CG）在MGO诱导的Fbs衰老模型中进行体外细胞验证。从衰老表型、细胞骨架网络、氧化应激、炎症微环境和ECM代谢等多个维度全面评估了其抗衰老功效。结果表明，KCBE和两种单体均能减少衰老细胞比例、改善细胞骨架组织、抑制促炎细胞因子分泌、增加I型胶原沉积，并伴随ECM相关基因表达的改变。总体而言，这些发现表明KCBE及其代表性化合物对MGO诱导的细胞损伤具有保护作用，并为深入研究KCB生物活性化合物在抗皮肤衰老方面的应用提供了基础。