新型真菌吡喃糖2-氧化酶（PsPOx）的鉴定、表征及其对胰腺癌细胞系的强效细胞毒性作用

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Identification and characterization of a novel fungal pyranose 2-oxidase from the Punctularia strigosozonata with potent cytotoxicity against pancreatic carcinoma cell lines

　　

吡喃糖氧化酶（pyranose oxidase，POx）是一种依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）的氧化还原酶，可催化D-葡萄糖氧化生成2-酮基-D-葡萄糖，并伴随产生过氧化氢（H2O2）。尽管POx已在多种真菌和细菌中得到充分表征，但其在癌症治疗中的潜力尚未被充分探索。本研究通过基因挖掘，从木材腐朽真菌Punctularia strigosozonata中鉴定出一种新型吡喃糖2-氧化酶，命名为PsPOx。该基因经密码子优化、合成并在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达。重组酶经纯化后进行生化表征。序列比对和结构建模证实PsPOx具有葡萄糖-甲醇-胆碱（glucose-methanol-choline，GMC）超家族的所有保守特征。动力学分析表明，PsPOx对D-葡萄糖表现出最高的催化效率（kcat/Km = 85.09 mM-1·s-1），Km值为0.8375 mM，表明其具有强底物亲和力。通过CCK-8实验，PsPOx对三种人胰腺癌细胞系（PANC-1、AsPC-1和BxPC-3）表现出剂量依赖性的强效细胞毒性，IC50值分别为257.8、195.2和176.2 ng·mL-1。然而，正常人胰腺上皮细胞系hTERT-HPNE的IC50值为195.6 ng·mL-1，与AsPC-1和BxPC-3相当，表明游离PsPOx在肿瘤细胞与正常细胞之间缺乏选择性。机制研究表明，PsPOx处理可增加细胞内和线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，诱导G0/G1细胞周期阻滞，下调Cyclin D1和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达，并触发BxPC-3细胞凋亡。这些结果初步证明PsPOx具有体外抗肿瘤活性，可作为进一步开发的候选分子。

论文解读：新型真菌吡喃糖2-氧化酶PsPOx的鉴定、表征及其抗胰腺癌活性研究

一、研究背景与科学问题

吡喃糖氧化酶（pyranose oxidase，POx）是一类依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）的氧化还原酶，属于葡萄糖-甲醇-胆碱（glucose-methanol-choline，GMC）氧化还原酶超家族，在碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active enZYme，CAZy）数据库中归类于辅助活性家族3亚家族4（AA3_4）。POx催化醛吡喃糖（优先D-葡萄糖）C-2位的区域选择性氧化，生成2-酮基-D-葡萄糖，同时将分子氧还原为过氧化氢（H₂O₂）。在木材腐朽真菌中，POx的生理功能主要与木质纤维素降解相关，通过产生H₂O₂为过氧化物酶提供底物。

近年来，生物催化在癌症治疗中的应用受到广泛关注，策略包括前药激活、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、肿瘤微环境中必需营养素的消耗以及抗体药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADCs）中的药物释放等。由于肿瘤细胞代谢重编程表现出有氧糖酵解偏好（Warburg效应），其葡萄糖消耗量约为正常细胞的十倍。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）作为GMC家族成员，已被广泛制成纳米制剂，通过消耗葡萄糖有效抑制肿瘤生长。然而，GOx在大肠杆菌（Escherichia coli）等原核宿主中异源表达存在表达量低、可溶性蛋白产量少及翻译后修饰不足等局限。POx与GOx具有相似的催化功能，但已在E. coli中实现良好表达，且能同时接受D-葡萄糖的α和β异头形式（GOx仅特异性识别β异头物），对D-葡萄糖的亲和力也显著高于GOx。尽管如此，POx的抗肿瘤潜力此前尚未被充分探索。基于此，研究人员从木材腐朽真菌Punctularia strigosozonata基因组中挖掘并鉴定了一种新型吡喃糖2-氧化酶PsPOx，系统表征其酶学性质，并评估其对胰腺癌细胞的体外细胞毒性及潜在机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员成功从P. strigosozonata基因组中鉴定出编码606个氨基酸的假定POx（命名为PsPOx，NCBI登录号XP_007389296.1），经密码子优化合成后构建重组E. coli菌株进行异源表达。纯化后的重组酶经生化表征确认其属于GMC超家族，保留真菌POx的所有保守特征。动力学分析显示PsPOx对D-葡萄糖具有最高的底物亲和力和催化效率。体外细胞毒性实验表明，PsPOx对三种人胰腺癌细胞系表现出剂量依赖性细胞毒性，但同时对正常胰腺上皮细胞也显示出相当的毒性，缺乏肿瘤选择性。机制研究揭示PsPOx通过诱导ROS积累、G0/G1细胞周期阻滞、下调增殖相关蛋白表达及触发凋亡来发挥抗肿瘤作用。该研究初步证明了PsPOx具有体外抗肿瘤活性，为其进一步开发为治疗候选分子奠定了基础。

三、主要关键技术方法

研究人员采用基因挖掘技术，以TmPOx氨基酸序列为查询序列，通过NCBI数据库BLASTP搜索P. strigosozonata基因组。序列分析使用Clustal Omega进行多序列比对，利用AlphaFold3预测PsPOx四聚体结构，并通过PyMOL基于TmPOx结构（PDB：1TT0）修饰获得活性口袋中共价His166-FAD。重组蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化，采用HRP-ABTS偶联法测定酶活性。细胞毒性评估使用CCK-8实验，ROS水平通过DCFH-DA和MitoSOX Red染色结合流式细胞术检测，细胞周期分析采用PI/RNase A染色，凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI双染法，蛋白表达水平通过Western blot检测。

四、研究结果

4.1 基因挖掘与异源表达

研究人员以TmPOx氨基酸序列为查询序列，通过NCBI数据库BLASTP在P. strigosozonata基因组中鉴定出一个编码606个氨基酸的全长开放阅读框，命名为PsPOx（XP_007389296.1），与TmPOx的查询覆盖率为94%。重组蛋白虽主要以包涵体形式存在于不溶组分中，但可溶性组分经Ni-NTA亲和层析纯化后获得活性酶，可溶性表达量为5.38 mg/L培养物，纯化回收率33.1%，纯化倍数7.67，纯化后PsPOx比活力为0.9705 U/mg。

4.2 序列与结构分析

多序列比对显示PsPOx与四种已报道真菌POx的序列一致性为45.61%–54.96%。PsPOx包含GMC氧化还原酶家族的所有标志性特征，特别是真菌吡喃糖2-氧化酶的特征。其含有FAD依赖性氧化还原酶典型的保守ADP结合βαβ基序（Rossmann折叠）。FAD附着基序（TmPOx中为¹⁶⁵STHW¹⁶⁸，负责通过His167进行共价8α-(N3)-组氨酰黄素化）在PsPOx中保守（¹⁶⁴TTHW¹⁶⁷，His166）。关键催化His-Asn对（TmPOx中H548和N593）在PsPOx中完全保守（H539和N582）。此外，PsPOx还含有推定寡聚化环和臂区（PsPOx残基102–158）、活性位点环（残基444–455）及头部结构域（残基382–422），表明其保留四聚体组织、共价结合FAD及H₂O₂生成所需的催化机制。

4.3 生化表征

PsPOx在pH 8.0时表现出最大活性，在酸性条件（pH低于5.0）下活性急剧下降，在pH 9.0和10.0时也显著降低，表明该酶在弱碱性环境中发挥最佳功能。最适温度为35 °C，超过45 °C后活性迅速下降。半失活温度（T₅₀³⁰）经曲线拟合计算为62.1 °C。热失活动力学显示，PsPOx在40 °C和45 °C下分别保持78.2%和62.6%的活性；在50 °C下10小时内丧失约82.1%的活性，半衰期（t_1/2）为4.68小时，表明该酶在中等高温条件下数小时内仍保持相当活性。

4.4 底物特异性与动力学参数

在测试底物中，PsPOx对D-葡萄糖表现出最高的比活力（0.9705 U/mg）和催化效率（k_cat/K_m = 85.09 mM^-1·min^-1），K_m值为0.8375 mM，表明对该天然底物具有高亲和力。对D-半乳糖、D-木糖和D-甘露糖的比活力显著较低（分别为0.0234、0.1031和0.0283 U/mg）。尽管D-甘露糖的转换数（61.26 min^-1）接近D-葡萄糖（71.26 min^-1），但其极高的K_m值（125.6 mM）导致催化效率仅为0.4877 mM^-1·min^-1，比葡萄糖低约175倍。1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-anhydroglucitol，1,5-AG）作为糖尿病监测的非传统生物标志物，PsPOx对其的K_m值为18.78 mM，催化效率为2.31 mM^-1·min^-1，在测试底物中排名第二。

4.5 对胰腺癌细胞系和正常胰腺上皮细胞的细胞毒性

CCK-8实验表明，PsPOx对三种人胰腺癌细胞系均表现出剂量依赖性显著细胞毒性。其中BxPC-3细胞最敏感，IC₅₀值为176.2 ng/mL；AsPC-1细胞中度敏感，IC₅₀值为195.2 ng/mL；PANC-1细胞敏感性最低，IC₅₀值为257.8 ng/mL。值得注意的是，正常胰腺上皮细胞系hTERT-HPNE对PsPOx也表现出相当敏感性，IC₅₀值为195.6 ng/mL，与AsPC-1和BxPC-3相当，表明游离PsPOx在肿瘤细胞与正常细胞之间缺乏选择性。

4.6 PsPOx处理后ROS产生评估

流式细胞术分析显示，PsPOx处理导致BxPC-3细胞内ROS水平剂量依赖性增加。DCF阳性细胞百分比从对照组的12.4%增加至176.2和352.4 ng/mL处理组的22.5%和27.3%。MitoSOX Red染色显示线粒体超氧化物产生更为显著，MitoSOX阳性细胞百分比从对照组的18.7%增加至52.8%和65.7%。结果表明PsPOx处理诱导胰腺癌细胞产生细胞内ROS积累和线粒体超氧化物。

4.7 PsPOx处理后细胞周期分析

细胞周期分布分析显示，PsPOx诱导G0/G1期细胞比例剂量依赖性增加，伴随S期减少。对照组G0/G1、S和G2/M期比例分别为38.3%、34.7%和25.9%。经176.2 ng/mL PsPOx处理后，G0/G1期增加至72.4%，S和G2/M期分别降至18.5%和7.22%。在352.4 ng/mL时，G0/G1期进一步增加至76.2%。结果表明PsPOx诱导胰腺癌细胞G0/G1细胞周期阻滞。

4.8 Cyclin D1和PCNA表达的Western blot分析

Western blot结果显示，与对照组相比，PsPOx处理导致Cyclin D1和PCNA蛋白水平剂量依赖性下降，而α-tubulin表达在各组中保持稳定，确认等量蛋白上样。灰度分析进一步证实PsPOx处理组中Cyclin D1和PCNA相对表达水平显著降低（P < 0.05）。这些结果与细胞周期分析一致，表明PsPOx通过下调关键增殖相关蛋白抑制胰腺癌细胞增殖。

4.9 PsPOx处理后凋亡/坏死诱导评估

Annexin V-FITC/PI双染结果显示，PsPOx诱导凋亡细胞群体剂量依赖性增加。对照组早期凋亡（Annexin V-FITC⁺/PI^?）和晚期凋亡（Annexin V-FITC⁺/PI⁺）细胞比例分别为3.16%和4.88%，总凋亡率约8.0%。经176.2 ng/mL处理后，早期和晚期凋亡群体分别增至3.68%和19.1%，总凋亡率约22.8%。在352.4 ng/mL时，晚期凋亡群体显著增至76.2%，总凋亡率约85.4%。坏死细胞比例在各组中均保持低水平（0.11%–0.36%），表明PsPOx主要诱导凋亡而非坏死。

五、讨论与结论

讨论部分指出，PsPOx在pH 8.0和35 °C下发挥最佳功能，半失活温度为62.1 °C，50 °C下半衰期为4.68小时，与已报道真菌POx相比具有中等热稳定性，优于多数细菌来源POx（如ScPOx的T₅₀³⁰为38 °C，AsPOx在40 °C下半衰期仅25分钟）。动力学分析表明PsPOx对D-葡萄糖的K_m值（0.8375 mM）显著低于GOx（如AnGOx为21.06 mM）。尽管游离PsPOx缺乏肿瘤选择性，但鉴于GOx具有相同抗肿瘤机制且同样存在靶向性不足的问题，已通过纳米制剂策略实现肿瘤靶向治疗，将PsPOx封装入合理设计的纳米载体可能有助于克服其靶向性不足并提高治疗指数。机制研究表明PsPOx通过葡萄糖消耗和H₂O₂/ROS介导的氧化应激发挥细胞毒性作用。然而，这些实验仅在体外进行，肿瘤微环境的复杂性以及PsPOx的药代动力学、生物分布和系统毒性尚未评估。

研究结论：研究人员成功从P. strigosozonata中鉴定出一种新型、生化特性稳健的真菌吡喃糖2-氧化酶PsPOx。该酶具有GMC超家族所有保守结构和催化特征，对D-葡萄糖表现出高底物特异性和催化效率，K_m值低，是一种高效的葡萄糖消耗酶。体外细胞毒性实验表明PsPOx以剂量依赖性方式降低胰腺癌细胞系活力，但同时也以相似程度影响正常胰腺上皮细胞，表明其游离形式缺乏肿瘤选择性。本工作初步证明PsPOx具有体外抗肿瘤活性，有望作为治疗候选分子。后续研究特别是体内评估和靶向递送策略，对于验证其治疗潜力至关重要。