《Frontiers in Veterinary Science》：Effects of betaine on growth performance and colonic microbiota in weaned piglets
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本研究探讨了日粮中添加甜菜碱对断奶仔猪生长性能、腹泻发生率及结肠微生物群的影响。研究人员将150头刚断奶的杜洛克×长白×大白仔猪随机分为三组：对照组（基础日粮）、低剂量组（基础日粮+1,250 mg/kg甜菜碱）和高剂量组（基础日粮+2,500 mg/kg甜菜
本研究探讨了日粮中添加甜菜碱对断奶仔猪生长性能、腹泻发生率及结肠微生物群的影响。研究人员将150头刚断奶的杜洛克×长白×大白仔猪随机分为三组：对照组（基础日粮）、低剂量组（基础日粮+1,250 mg/kg甜菜碱）和高剂量组（基础日粮+2,500 mg/kg甜菜碱）。评估了生长性能和腹泻发生率，并通过16S rRNA基因测序分析了结肠微生物组成，进一步利用PICRUSt2和Tax4Fun2预测了微生物群的功能潜力。结果显示，与对照组相比，两个甜菜碱补充组的平均日增重（ADG）显著提高，饲料转化率（FCR）和腹泻发生率显著降低（p < 0.05）。探索性随机森林分析识别出若干候选属，包括Prevotellaceae_NK3B31_group、Oscillibacter、Oscillospira和Ruminococcus_torques_group，这些属有助于区分不同处理组。具体而言，低剂量甜菜碱改变了多个属的相对丰度，如Prevotellaceae_NK3B31_group、Oscillibacter、Oscillospira和Ruminococcus_torques_group。功能预测进一步表明，低剂量甜菜碱与能量代谢相关的预测KEGG通路富集有关，包括柠檬酸循环（TCA循环）（ko00020）、丁酸代谢（ko00650）和叶酸生物合成（ko00790）。总体而言，日粮中添加甜菜碱改善了断奶仔猪的生长性能并降低了腹泻发生率。这些表型改善伴随着特定结肠细菌类群和预测微生物功能的变化。然而，由于未直接测量微生物代谢物、短链脂肪酸（SCFAs）、肠道屏障功能和免疫指标，因此微生物群相关的研究结果应视为关联性发现，需进一步验证。
研究背景与目的
在现代养猪生产中，断奶应激是影响仔猪健康和生产力的关键挑战之一。母仔分离、日粮从母乳向固体饲料的突然转变、环境变化及社会重组等因素共同诱发生理和心理应激，导致采食量下降、肠道形态受损、肠道通透性增加、免疫功能紊乱、氧化应激以及断奶后腹泻的高发。此外，断奶应激会严重破坏肠道微生态系统，引发微生物失调、定植抗力下降及条件致病菌扩增，进一步加剧肠道炎症和代谢紊乱。鉴于肠道微生物群在营养代谢、短链脂肪酸（SCFAs）产生、维持肠道屏障完整性和免疫稳态中发挥不可或缺的作用，通过调节肠道微生物群来缓解断奶应激的营养策略作为减少断奶后腹泻和抗生素使用的有效替代方案日益受到关注。
甜菜碱是一种天然存在的季铵化合物，兼具甲基供体和渗透保护剂的双重功能。已有研究表明，甜菜碱参与蛋白质和脂质代谢，增强抗氧化能力，缓解应激反应，并维持细胞渗透平衡。在猪营养学中，日粮中添加甜菜碱已被证明可改善养分消化率、促进生长性能并减少断奶后腹泻。此外，甜菜碱可能通过调节肠道微生物组成和发酵过程、促进有益菌增殖、增强肠道屏障功能及调控宿主免疫应答来影响肠道健康。然而，目前关于甜菜碱的研究主要集中在生长性能和营养代谢方面，其对断奶仔猪结肠微生物结构、功能特性及微生物-功能相互作用的影响仍知之甚少。
因此，本研究旨在评估日粮中添加甜菜碱（1,250和2,500 mg/kg）对断奶仔猪生长性能、腹泻发生率及结肠微生物特征的影响，并进一步利用PICRUSt2和Tax4Fun2探讨预测微生物功能的变化是否与甜菜碱补充相关。研究假设日粮甜菜碱补充可改善生长性能并降低腹泻发生率，且这些表型响应可能伴随结肠微生物组成和预测功能潜力的改变。该研究并非旨在建立微生物介导的因果机制，而是识别可能与甜菜碱表型效应相关的微生物和预测功能特征。
主要技术方法
研究人员选用150头28日龄健康的杜洛克×长白×大白断奶仔猪，采用完全随机设计分为三组（每组5个重复，每重复10头猪）：对照组（基础日粮）、低剂量组（基础日粮+1,250 mg/kg甜菜碱）和高剂量组（基础日粮+2,500 mg/kg甜菜碱）。试验持续35天（含5天适应期和30天正式试验期）。生长性能参数（平均日增重ADG、平均日采食量ADFI、饲料转化率FCR）以栏为单位计算，腹泻发生率通过粪便评分确定。结肠食糜样本采集后，提取总基因组DNA，对细菌16S rRNA基因V3-V4高变区进行PCR扩增，并在Illumina MiSeq平台进行双端300 bp测序。测序数据经质控后以97%相似度聚类为操作分类单元（OTUs），并使用RDP分类器进行物种注释。功能预测采用PICRUSt2和Tax4Fun2两种工具完成。统计分析中，生长性能和腹泻数据采用单因素方差分析（ANOVA），微生物α多样性采用Kruskal-Wallis检验，β多样性基于Bray-Curtis距离矩阵进行主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA），差异微生物类群和预测KEGG通路采用Wilcoxon秩和检验并经Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）校正，同时采用探索性随机森林分析和Spearman相关性分析。
研究结果
3.1 甜菜碱对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响
日粮中添加甜菜碱显著影响了断奶仔猪的生长性能。与对照组相比，低剂量和高剂量甜菜碱组的平均日增重（ADG）显著升高，饲料转化率（FCR）和腹泻率均显著降低。高剂量组的腹泻发生率显著低于低剂量组。各组间的平均日采食量（ADFI）无显著差异。
3.2 甜菜碱对断奶仔猪结肠微生物多样性和组成的影响
在α多样性方面，三组间观察到的物种数（S.obs）、Chao1丰富度估计值、Shannon指数和Simpson指数均无显著差异，表明甜菜碱补充未显著影响结肠微生物群的物种丰富度和群落均匀度。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）未显示各组间微生物群落结构的明显分离，PERMANOVA也确认β多样性在三组间无显著差异。在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）在所有组中占主导地位，其次是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门（Actinobacteriota）。在属水平，优势属包括乳酸菌属（Lactobacillus）、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）、梭菌属sensu stricto 1（Clostridium_sensu_stricto_1）等，整体分类组成在三组间大致可比。
3.3 探索性随机森林分析鉴定的候选判别性属
探索性随机森林模型根据平均下降精度（MDA）识别出20个对组间判别有重要贡献的属。其中，Prevotellaceae_NK3B31_group、颤螺菌属（Oscillospira）、Oscillibacter、Ruminococcus_torques_group和norank_UCG-010显示出较高的重要性得分。进一步比较显示，12个属在不同处理组间存在显著差异。与对照组相比，低剂量组中Prevotellaceae_NK3B31_group、norank_Peptococcaceae、unclassified_Bacteroidales、颤螺菌属（Oscillospira）、Oscillibacter、norank_UCG-010和unclassified_Selenomonadaceae的相对丰度显著升高，而Ruminococcus_torques_group显著降低。与低剂量组相比，高剂量组中Prevotellaceae_NK3B31_group、norank_Peptococcaceae、unclassified_Bacteroidales、Fibrobacter和Eubacterium_xylanophilum_group显著降低，而Syntrophococcus显著升高。此外，与对照组相比，高剂量组中norank_Bradymonadales显著升高。
3.4 断奶仔猪结肠微生物属的相关性
Spearman相关性分析显示，多个差异细菌属之间存在显著的互作模式。Oscillibacter与颤螺菌属（Oscillospira）和norank_UCG-010呈显著正相关；颤螺菌属还与unclassified_Selenomonadaceae和Eubacterium_xylanophilum_group呈正相关。Prevotellaceae_NK3B31_group与Oscillibacter、颤螺菌属、norank_UCG-010和norank_Bradymonadales呈正相关，但与Syntrophococcus和Ruminococcus_torques_group呈负相关。Ruminococcus_torques_group与Peptococcus和Solobacterium呈正相关，而与Prevotellaceae_NK3B31_group、Oscillibacter和颤螺菌属呈负相关。
3.5 甜菜碱补充下结肠微生物群的预测功能谱
PICRUSt2预测结果显示，与对照组相比，低剂量组在多个KEGG三级功能通路上显著富集，包括叶酸生物合成（ko00790）、硫辛酸代谢（ko00785）、脂多糖生物合成（ko00540）和柠檬酸循环（ko00020）。在低剂量组与高剂量组的比较中，高剂量组在烟酸和烟酰胺代谢（ko00760）以及果糖和甘露糖代谢（ko00051）上显著更高。Tax4Fun2预测进一步表明，与低剂量组相比，对照组的丁酸代谢（ko00650）、花生四烯酸代谢（ko00590）以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化（ko00040）显著较低。
3.6 结肠微生物群与预测KEGG功能的探索性共变网络分析
Spearman相关性分析显示，多个属与预测KEGG通路存在共变关系。norank_Selenomonadaceae、unclassified_Selenomonadaceae和norank_UCG-010均与预测的丁酸代谢（ko00650）、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化（ko00040）、柠檬酸循环（ko00020）和脂多糖生物合成（ko00540）呈正相关。Oscillibacter和颤螺菌属（Oscillospira）与ko00020呈正相关。相反，某些属与特定预测通路呈负相关，例如多个属与果糖和甘露糖代谢（ko00051）呈负相关，unclassified_Firmicutes则与多个通路呈广泛负相关。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究发现日粮中添加1,250和2,500 mg/kg甜菜碱显著提高了断奶仔猪的平均日增重（ADG），改善了饲料转化率（FCR），并降低了腹泻发生率，这与先前研究一致。然而，甜菜碱补充并未显著影响肠道微生物群的α或β多样性，表明其作用主要体现在特定分类水平和潜在功能水平的精细调节上。低剂量组中与碳水化合物利用相关的属（如Prevotellaceae_NK3B31_group、unclassified_Bacteroidales和Fibrobacter）以及发酵相关属（Oscillibacter和颤螺菌属Oscillospira）丰度升高，而Ruminococcus_torques_group丰度降低。功能预测揭示了能量代谢和辅因子代谢相关通路的差异。但研究者强调，由于未直接测量短链脂肪酸（SCFAs）、微生物代谢物、肠道屏障功能和免疫指标，这些微生物相关发现仅为关联性和假设生成性质。此外，表型和微生物响应的不完全剂量依赖性提示甜菜碱的有益效应也可能涉及不依赖于微生物群的宿主相关机制。研究局限性包括微生物组样本量较小、功能预测基于16S rRNA基因推断、缺乏直接代谢产物和生理指标测量等。
研究结论翻译如下：
总之，日粮中添加1,250和2,500 mg/kg甜菜碱改善了断奶仔猪的生长性能并降低了腹泻发生率，而未显著改变整体结肠微生物多样性。不同处理组间存在若干细菌属和预测KEGG通路的差异，尤其在低剂量甜菜碱组中更为明显，这表明甜菜碱补充可能与结肠微生物组成和预测功能潜力的变化相关。然而，由于短链脂肪酸（SCFAs）、微生物代谢物、肠道屏障功能和免疫标志物未被直接测量，这些微生物相关发现应被视为关联性和假设生成性的。需要整合宏基因组学、代谢组学、SCFA测量和宿主肠道生理指标的进一步研究来阐明甜菜碱在断奶仔猪中发挥有益效应的机制。
