《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Transection of the cervical sympathetic trunk ameliorates pulmonary arterial hypertension by reprogramming transcription factor networks and alternative splicing in rat model
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背景：颈交感干横断术（TCST）可改善肺动脉高压（PAH），但其分子机制尚不明确。本研究旨在通过转录组学分析，阐明TCST在野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠模型中的作用机制。
方法：将PAH大鼠分为对照组、PAH组、PAH+假手术组和PAH+TCST组。通过
背景：颈交感干横断术（TCST）可改善肺动脉高压（PAH），但其分子机制尚不明确。本研究旨在通过转录组学分析，阐明TCST在野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠模型中的作用机制。
方法：将PAH大鼠分为对照组、PAH组、PAH+假手术组和PAH+TCST组。通过血流动力学和组织学评估治疗效果。对肺组织进行RNA测序（RNA-seq）以鉴定差异表达基因（DEGs），随后进行转录因子（TF）网络分析和可变剪接分析，并通过实时荧光定量PCR（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）进行验证。
结果：TCST显著降低平均肺动脉压（mPAP）、右心室收缩压（RVSP）和右心室肥厚指数（RVHI），并减轻血管重构。RNA-seq共鉴定出500个DEGs（61个上调，439个下调）。TF网络分析显示，差异表达TF的靶基因富集于炎症、增殖和钙信号通路。多个PAH相关基因（Bmp2、Ptgs2、Cxcl13、Wnt7b、Tacr1、Adra1d）在TCST后表达下调。可变剪接分析显示，TCST调节RNA结合蛋白（RBP）的表达，并改变PAH相关基因（Aldh2、Il1rn、Foxm1）的剪接模式。qPCR和ELISA证实Foxa3/Adra1d-Tacr1轴的抑制及三磷酸肌醇（IP3）生成的减少。
结论：TCST通过选择性重编程TF网络和调节RBP介导的可变剪接发挥治疗作用，在转录和转录后水平协调抑制PAH相关通路。这些发现为开发基于神经调节的PAH治疗策略提供了机制见解和理论基础。
一、研究背景与意义
肺动脉高压（PAH）是一种进行性、异质性的疾病，以静息状态下平均肺动脉压（mPAP）持续升高超过20 mmHg为主要特征，主要由肺血管过度收缩和肺血管系统的适应不良性结构重构引起。这一病理过程导致肺血管阻力（PVR）增加、右心室（RV）后负荷加重，最终导致右心衰竭和死亡。目前临床药物治疗主要针对三条经典通路：前列环素、内皮素-1和一氧化氮系统。尽管这些疗法能显著改善患者生活质量和运动能力，但长期生存获益仍有限，亟需新的治疗策略。
研究表明，除经典通路外，多条异常信号通路在PAH发病中发挥关键作用。肺血管平滑肌细胞（PASMCs）的异常增殖是肺血管重构的标志性特征，由MAPK、PI3K/Akt和钙依赖性通路等失调信号级联驱动。同时，炎症已成为PAH发病的重要贡献因素，表现为巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞的血管周围浸润，以及IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子水平升高。值得注意的是，越来越多的证据提示同时靶向PASMC增殖和炎症可能带来治疗获益。
肺血管接受交感、副交感和感觉神经支配。交感神经主要通过α-肾上腺素能受体介导血管收缩并升高血管阻力。过去二十年的证据一致表明PAH常伴随交感神经系统（SNS）过度激活，且SNS活性升高与不良预后相关。已探索多种减弱SNS激活的策略，包括肾去神经术和肺动脉去神经术（PADN），但这些方法的精确机制尚未完全阐明，且射频消融存在血管狭窄或副交感神经意外损伤风险。星状神经节阻滞（SGB）是一种调节交感神经活性的技术，颈交感干横断术（TCST）被认为是模拟SGB长期效应的合适动物模型。初步研究表明TCST可改善大鼠PAH症状，但其具体分子机制尚不清楚。
二、研究内容与结论
本研究建立了野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠模型，系统评估TCST对肺动脉压、右心室功能和肺组织病理的影响。通过全转录组测序分析TCST干预后肺组织中差异表达基因及其相关信号通路，重点关注转录因子网络和RNA结合蛋白（RBP）介导的可变剪接。研究旨在从转录和转录后水平阐明TCST缓解PAH的潜在分子机制，为基于神经免疫调节的PAH治疗策略提供理论基础。
研究得出以下主要结论：TCST显著减轻肺血管重构并降低mPAP、RVSP和RVHI；TCST重塑差异表达转录因子的共表达网络，其靶基因富集于炎症、增殖和钙信号等功能模块；TCST调节多个RBP的表达及其下游靶基因的可变剪接模式；TCST通过Foxa3/Adra1d-Tacr1轴抑制钙信号通路，降低IP3水平。这些发现为理解TCST改善PAH的分子机制提供了新见解。
三、主要技术方法
研究人员使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（体重180–220 g，6–8周龄，购自湖北贝恩特生物动物中心），随机分为四组：正常对照（NC）组、PAH组、PAH+假手术组和PAH+TCST组。通过皮下注射MCT（60 mg/kg）诱导PAH，TCST手术在MCT注射后第7天进行。采用右心导管法测量RVSP和mPAP，计算RVHI评估右心室肥厚程度。肺组织进行苏木精-伊红（H&E）染色评估病理改变。对PAH+sham和PAH+TCST组各3个生物学重复进行链特异性RNA-seq（Illumina NovaSeq Xplus平台，150 bp双端测序）。使用HISAT2比对到参考基因组，DESeq2鉴定DEGs，KOBAS进行GO和KEGG富集分析。利用AnimalTFDB4数据库和GTRD数据库预测转录因子结合位点，通过Pearson相关系数进行共表达分析。使用ABLas流程进行可变剪接分析。qPCR、Western blot和ELISA用于验证关键分子表达。
四、研究结果
3.1 TCST缓解MCT诱导PAH大鼠的肺动脉高压
通过MCT建立PAH大鼠模型并实施TCST，以同侧Horner综合征（眼球内陷、瞳孔缩小和上睑下垂）确认手术成功。与NC组相比，PAH和PAH+sham组大鼠表现出显著的肺泡结构损伤、肺间质和小肺动脉壁明显增厚、管腔狭窄、内皮细胞连续性中断及中膜平滑肌细胞增殖肥大。TCST组病理特征显著改善，肺泡结构相对保留。血流动力学方面，TCST显著降低mPAP和RVSP，并改善右心室肥厚程度。
3.2 TCST通过抑制炎症和钙驱动的增殖调节基因表达以减轻PAH
对PAH+sham和PAH+TCST组肺组织进行RNA-seq，PCA显示两组间基因表达谱发生显著变化。共鉴定出500个DEGs（61个上调，439个下调）。上调DEGs富集于蛋白结合、RNA聚合酶II顺式调控区序列特异性DNA结合等分子功能，以及炎症反应、免疫反应、凋亡反应等生物学过程。下调DEGs富集于钙离子结合、钙依赖性蛋白结合、ATP结合、生长因子活性等分子功能，以及适应性免疫反应、钙离子浓度正调控、细胞增殖正调控等生物学过程。KEGG分析显示下调基因富集于补体级联、细胞因子-细胞因子受体相互作用、原发性免疫缺陷、钙信号通路、PPAR信号通路、AMPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。
3.3 TCST重塑PAH中的转录因子调控网络
将DEGs与转录因子数据集交叉分析，鉴定出15个差异表达转录因子（DETFs）。其中Zbtb16、Nkx2-8、Klf2、Nr1d1、Dbp和Zfp683显著上调，Bhlha15、Tcf24、Barx2、Pax9、Foxa3、Nr1i2、Tbxt、Elf3和AABR07030823.1下调。与DETFs共表达的基因显著富集于炎症反应、细胞群体增殖正调控、胞质钙离子浓度正调控和钙介导信号传导等生物学过程。调控网络显示炎症反应通路基因与钙信号和增殖模块相连。六个具有促PAH作用的基因——Bmp2、Ptgs2、Cxcl13、Wnt7b、Tacr1和Adra1d——在TCST后显著下调。
3.4 TCST抑制钙信号通路激活
鉴于钙信号通路是TF共表达网络的关键靶点，且Adra1d和Tacr1显著下调，研究人员进一步验证钙信号通路的激活状态。通过GTRD数据库筛选预测结合Adra1d和Tacr1启动子区域的转录因子，与下调DEGs交叉后鉴定出Foxa3为共同候选调控因子。JASPAR和FIMO预测在两者启动子区域发现多个FOXA3结合基序（GTAAACA）位点。共表达分析显示Foxa3与Adra1d（r=0.96）和Tacr1（r=0.95）呈强正相关。qPCR证实TCST组Foxa3、Adra1d和Tacr1的mRNA表达显著下调，Plcb1（编码磷脂酶Cβ1）表达也显著降低。Western blot证实FOXA3蛋白水平下降。ELISA显示TCST组IP3浓度显著低于sham组。
3.5 TCST通过RBP介导的转录后调控调节可变剪接
ABLas分析鉴定出多种类型的可变剪接事件（ASEs），包括A5SS、A3SS、互斥外显子（MXE）、内含子保留（IR）、外显子跳跃（ES）等。TCST与sham组间鉴定出大量差异剪接（DAS）事件，以IR、A5SS和A3SS为主。DAS基因富集于凋亡、转录调控、细胞黏附和流体剪切应力等通路。共鉴定出14个差异表达RBP，构建了RBP-DAS基因共表达网络。三个PAH相关基因表现出显著剪接变化：Aldh2的A3SS降低，Il1rn的A5SS增加，Foxm1的A3SS增加。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次系统描绘了TCST处理PAH模型中差异表达转录因子的双向调控图谱，提示TCST选择性重编程转录网络。多个PAH相关基因的协调下调表明TCST可能通过系统性抑制多个PAH相关转录程序，在转录水平发挥广谱病理网络阻断效应。钙信号通路抑制可能对增殖和炎症通路产生协同效应。在转录后水平，RBP表达调控介导的可变剪接变化可能参与TCST的治疗效应。研究局限性包括：调控网络主要基于生物信息学预测，需ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、RIP或CLIP-seq验证；需通过功能获得或缺失实验验证生物学功能；MCT模型不能完全反映人类PAH的异质性；TCST临床转化面临挑战，未来应探索微创或可逆性交感调节策略。
结论部分：本研究证明TCST有效缓解MCT诱导PAH大鼠模型的肺血管重构和血流动力学异常。机制上，TCST通过选择性重编程转录因子网络和调节RBP介导的可变剪接，在转录和转录后水平协调调节多个PAH相关通路，包括炎症、增殖和钙信号。这些发现加深了对交感神经系统参与PAH发病机制的理解，为基于神经免疫调节的PAH治疗策略开发提供了理论基础。
