FaesMYB15-FaesELF3模块调控红花长花柱型普通荞麦开花时间、花器官数目与花色

《Frontiers in Plant Science》：The FaesMYB15-FaesELF3 module regulates flowering time, floral organ number, and floral color in red flower long-homostyle common buckwheat

　　

摘要 EARLY FLOWERING 3（ELF3）是晚间复合体（Evening Complex，EC）的核心成员，在植物生物钟调控开花过程中发挥关键作用。R2R3-MYB转录因子（transcription factors，TFs）通过调控参与花青素积累的结构基因的转录，在多种植物中控制花青素的合成，并在花发育中发挥重要作用。然而，ELF3同源基因如何与R2R3-MYB转录因子协同调控开花、花器官发育及花色，目前尚不清楚。本研究中，R2R3-MYB转录因子FaesMYB15直接结合普通荞麦FaesELF3启动子并抑制其表达。此外，在红花长花柱型（long-homostyle，LH）普通荞麦（Fagopyrum esculentum）中过表达FaesELF3可显著提早开花并促进植株快速生长，同时导致转基因植株花被片和雄蕊数目增加、花被片颜色变浅。此外，35S::FaesELF3株系花序中的总花青素含量显著低于正常红花LH普通荞麦。FaesELF3过表达显著下调了两个核心生物钟基因FaesPRR5–1和FaesPRR5-2，以及两个参与开花调控的AGAMOUS（AG）类MADS-box基因FaesAGL18和FaesAGL19的表达。该研究提出了一个参与调控作物开花时间、花色及花器官数目的FaesMYB15-FaesELF3新调控模块，为普通荞麦开花调控和花色改良的新型育种策略提供了见解。

论文解读

一、研究背景与科学问题

开花时间是植物重要的农艺性状，直接关系到作物的产量和品质。植物生物钟（circadian clock）是内源性时间调控系统，通过感知光周期和温度等环境信号，协调植物的生长发育与开花转换。EARLY FLOWERING 3（ELF3）作为晚间复合体（Evening Complex，EC）的核心成员，与EARLY FLOWERING 4（ELF4）和LUX ARRHYTHMO（LUX）共同构成植物生物钟的重要转录抑制复合体。在拟南芥中，ELF3不仅作为光信号调节因子，还作为温度传感器参与温度形态建成；在水稻中，OsELF3参与光周期开花调控；在小麦中，ELF3通过调控PPD1和FT1影响抽穗期；在大麦中，ELF3的SNP突变可加速植株发育。然而，ELF3同源基因如何与R2R3-MYB转录因子协同调控开花、花器官发育及花色，此前尚不清楚。

普通荞麦（Fagopyrum esculentum）是一种孤儿作物，具有异型自交不亲和性（heteromorphic self-incompatibility，HSI），其花为二型花，仅长花柱短雄蕊（pin）与短花柱长雄蕊（thrum）之间可成功交配。HSI是建立纯系和固定农艺优良基因的主要障碍，也是导致普通荞麦产量低的重要原因。研究人员此前从红花长花柱型（long-homostyle，LH）普通荞麦中分离了ELF3直系同源基因FaesELF3，并发现FaesELF3沉默植株产生部分雄蕊短花丝和空花药（雄性不育花药）的花。此外，下调FaesMYB15表达可导致红花LH普通荞麦花被片颜色变浅、雄蕊数目增加（九枚雄蕊）。FaesMYB15沉默植株与FaesELF3过表达植株表现出相似的花表型。基于此，研究人员开展本研究，旨在阐明FaesMYB15与FaesELF3之间的调控关系及其对开花时间、花器官数目和花色的协同调控机制。

二、研究内容与主要结论

本研究通过酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）实验、双荧光素酶报告基因（dual-luciferase reporter，DLR）实验和凝胶迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），证实R2R3-MYB转录因子FaesMYB15直接结合FaesELF3启动子并抑制其表达。在红花LH普通荞麦中过表达FaesELF3可显著提早开花（5–8天）、促进植株快速生长，并使花被片数目增加至六枚、雄蕊数目增加至九枚、花被片颜色变浅。转录组分析显示，FaesELF3过表达显著下调了核心生物钟基因FaesPRR5–1和FaesPRR5-2、两个AG类MADS-box基因FaesAGL18和FaesAGL19，以及花青素生物合成和转运相关基因的表达，导致总花青素含量显著降低。该研究首次提出了FaesMYB15-FaesELF3调控模块，揭示了其参与调控开花时间、花器官数目和花色的分子机制，为普通荞麦及其他作物的开花调控和花色改良育种提供了新思路和理论支持。

三、主要技术方法

研究人员以中国湖北省荆州市自然条件下种植的红花LH普通荞麦为材料，采集盛花期花序和花朵用于后续分析。研究采用了以下关键技术方法：（1）酵母单杂交（Y1H）实验，验证FaesMYB15与FaesELF3启动子（?24/+554区域）的直接结合；（2）双荧光素酶报告基因（DLR）实验，在本氏烟（N. benthamiana）叶片中检测FaesMYB15对FaesELF3表达的激活或抑制作用；（3）凝胶迁移率变动分析（EMSA），进一步确认FaesMYB15重组蛋白与FaesELF3启动子区域的特异性结合；（4）农杆菌介导的花序浸蘸法转化红花LH普通荞麦，获得35S::FaesELF3转基因株系；（5）比较转录组学分析（RNA-seq），对35S::FaesELF3转基因株系与对照（CK）花序进行差异表达基因（DEGs）鉴定、GO和KEGG富集分析；（6）pH示差分光光度法测定花序总花青素含量；（7）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达。

四、研究结果

1. 1.
   FaesMYB15通过直接结合pFaesELF3抑制FaesELF3转录

Y1H实验表明FaesMYB15可直接结合FaesELF3启动子区域（?24/+554）。DLR实验进一步证实FaesMYB15在植物体内下调FaesELF3表达，FaesMYB15存在时LUC/REN荧光比值较对照显著降低（p < 0.05）。EMSA实验确认FaesMYB15重组蛋白可与标记探针结合产生迁移条带，加入100倍冷竞争探针后条带消失。此外，pFaesMYB15::FaesMYB15转基因LH荞麦花中FaesELF3表达水平显著下降。以上结果表明FaesMYB15直接抑制FaesELF3以调控LH荞麦花发育。

1. 2.
   35S::FaesELF3转基因红花LH普通荞麦的表型分析

通过农杆菌介导转化获得四个独立35S::FaesELF3转基因株系。其中35S::FaesELF3-L1（25%）产生花被片数目增加（六枚花被片）的花（Type I）；35S::FaesELF3-L2（25%）产生花被片数目增加且花被片颜色变浅的花（Type II）；35S::FaesELF3-L3和35S::FaesELF3-L4（50%）产生花被片数目增加（六枚）、雄蕊数目增加（九枚）且花被片颜色变浅的花（Type III）。与正常红花LH普通荞麦相比，四个转基因株系均表现出提早开花（5–8天）和植株快速生长的表型。所有转基因株系中FaesELF3表达水平均显著升高（p < 0.05，LSD），其中35S::FaesELF3-L4表达水平最高，其花表型变化最显著；35S::FaesELF3-L1表达水平最低，仅表现为花被片数目增加而无花色变化。

1. 3.
   35S::FaesELF3转基因株系与正常红花LH普通荞麦花序的比较转录组分析

主成分分析（PCA）显示35S::FaesELF3转基因株系与LH普通荞麦样本明显分离，表明转录组谱差异显著且生物学重复间重现性高。差异表达基因（DEGs）包括2157个上调基因和2417个下调基因。GO富集分析显示下调DEGs显著富集于细胞壁组织、细胞壁修饰、外部封装结构组织等生物学过程，分子功能富集于果胶酯酶（PE）活性和钙离子结合，细胞组分富集于细胞外周和胞外区域。KEGG富集分析显示上调基因富集于植物生物钟通路。上调基因中开花调控相关基因如SOC1样FaesSOC1和FT样FaesFT表达升高。热图分析显示FaesELF3过表达显著下调了与伪反应调节因子（PRR）、果胶代谢、AG类MADS-box蛋白和钙信号相关的基因表达。qRT-PCR验证了三个PRR基因（FaesPRR5-1、FaesPRR5-2、FaesPRR95）、一个PE基因（FaesPE21-4）、两个AG类MADS-box基因（FaesAGL18、FaesAGL19）、一个钙依赖性蛋白激酶基因（FaesCDPK28）和一个钙结合蛋白基因（FaesCML23）在转基因株系中均下调表达，与转录组数据一致。

1. 4.
   FaesELF3过表达抑制红花LH普通荞麦花被片花青素积累

KEGG富集分析显示下调DEGs显著富集于苯丙烷生物合成和类黄酮生物合成两条花青素合成相关通路。热图分析显示花青素生物合成和转运相关基因在35S::FaesELF3转基因株系中显著下调，包括花青素生物合成结构基因FeCHS2、FeF3H、FeLDOX及多个与花青素转运相关的FeGST家族基因。各35S::FaesELF3株系花序总花青素含量均显著低于正常红花LH普通荞麦。结果表明花被片颜色变浅的表型与花青素生物合成相关基因的转录变化及花青素积累减少有关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，FaesELF3过表达促进开花和植株快速生长，FaesSOC1和FaesFT表达在转基因植株中明显升高，FaesPRR5–1和FaesPRR5-2表达显著下调，表明ELF3-PRR通路参与调控开花在普通荞麦中进化保守。在玉米中，ZmELF3.1通过形成EC调控开花，并直接与RA2和ZmELF4.2互作形成ELF3–ELF4–RA2复合体，增强RA2与TSH4启动子结合从而抑制TSH4表达，减少雄穗分枝数；小麦中ELF3截断突变在长短日照条件下均提早开花且每穗小穗数减少。这些结果表明ELF3同源基因在不同植物中已进化为调控花器官数目。本研究中FaesELF3过表达导致花被片和雄蕊数目增加、花被片颜色变浅，与FaesMYB15沉默表型相似。结合Y1H、DLR和EMSA实验证实FaesMYB15直接结合FaesELF3启动子并抑制其表达，研究人员提出了FaesMYB15-FaesELF3新调控模块，介导植物花器官数目、花色和开花时间的调控。

结论部分：本研究旨在阐明生物钟组分FaesELF3如何调控红花LH普通荞麦的开花时间和花发育。Y1H、DLR和EMSA实验表明R2R3-MYB转录因子FaesMYB15直接结合FaesELF3启动子并抑制其表达。此外，在35S::FaesELF3转基因红花LH普通荞麦中过表达FaesELF3可显著提早开花并促进植株快速生长，导致花被片和雄蕊数目增加、花被片颜色变浅。35S::FaesELF3株系花序总花青素含量显著低于正常红花LH普通荞麦。FaesELF3过表达显著下调了两个普通荞麦核心生物钟基因FaesPRR5–1和FaesPRR5-2，以及两个参与开花调控的AG类MADS-box基因FaesAGL18和FaesAGL19的表达。该研究提出了参与调控植物开花时间、花色和花器官数目的FaesMYB15-FaesELF3新调控模块，为普通荞麦开花时间和花色遗传育种提供了新见解。