衰老供体心脏静态冷保存中衰老调节剂芦可替尼（ruxolitinib）对心脏收缩功能的保护作用研究

《Frontiers in Transplantation》：Improved preservation of hearts from old donors during static cold storage by the senomorphic agent ruxolitinib

　　

目的： 来自老年供体的心脏更易发生原发性移植物功能障碍（PGD），推测是由于其对缺血再灌注损伤（IRI）的耐受性降低，部分由促炎细胞因子驱动。不断积累的衰老细胞分泌衰老相关分泌表型（SASP），其中包含促炎细胞因子，可能加剧缺血再灌注损伤。衰老调节剂可阻断衰老相关分泌表型。研究人员研究了衰老调节剂芦可替尼对老年供体心脏收缩功能的影响。 方法： 研究人员获取24月龄雄性和雌性C57BL6/J小鼠的心脏，使用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）溶液进行静态冷保存（SCS）2小时，分别添加或不添加芦可替尼（HTK+Ruxo），并在静态冷保存前后测量心脏收缩功能。对照组心脏不进行静态冷保存（每组及每个性别N=5）。研究人员测定了静态冷保存后衰老相关分泌表型相关细胞因子的释放、JAK通路及硝基酪氨酸水平。 结果： 尤其在雌性小鼠心脏中（发育压，DP：111±17% vs. 44±10%，p<0.05）以及（压力下降最小斜率，dp/dtmin：103±13% vs. 78±8%），但在雄性小鼠心脏中也是如此，HTK+Ruxo组的 ventricular 功能（DP，71±9% vs. 47±18%；dp/dtmin，87±7% vs. 54±10%）高于HTK组。IL-1α、IL-7和硝基酪氨酸水平在HTK-Ruxo组中较低，与性别无关，而TNFα仅在雌性小鼠心脏中较低。雄性小鼠心脏HTK组中JAK2的磷酸化水平升高。 结论： 衰老调节剂芦可替尼可改善老年供体小鼠心脏在静态冷保存期间的收缩功能并调节衰老相关分泌表型相关细胞因子释放，且在雌性心脏中效果更为显著。

论文解读

一、研究背景与目的

心脏移植（HTX）是终末期心力衰竭最有效的治疗手段，但供体器官短缺是全球性难题。为扩大供体池，欧洲越来越多的移植中心开始接受扩大标准供体（如老年供体）的心脏。然而，老年供体心脏移植后原发性移植物功能障碍（PGD）的发生率显著升高，患者预后较差。既往荟萃分析还提示，女性供体性别也可能是PGD的危险因素。尽管离体血液灌注（ex vivo blood perfusion）在老年供体心脏保存方面取得了一定进展，但该技术尚未在临床常规应用，静态冷保存（SCS）仍是最便捷且成本效益最高的器官保存方法。在静态冷保存期间实现有效的心肌保护对于预防缺血再灌注损伤（IRI）至关重要，而缺血再灌注损伤正是PGD的潜在原因之一，在老年供体心脏中可能更为关键。

随着年龄增长，组织中衰老细胞数量增加。衰老细胞分泌一组称为衰老相关分泌表型（SASP）的生物分子，其中包括促炎细胞因子。已知此类细胞因子可部分介导或加剧缺血再灌注损伤。衰老调节剂芦可替尼（ruxolitinib）是一种Janus激酶（JAK）1和2抑制剂，可阻断衰老相关分泌表型分泌，因此可能成为器官保存的保护剂。研究人员既往已在血管缺血再灌注损伤模型中证实芦可替尼可减轻缺血再灌注损伤介导的内皮功能障碍，且在雌性受试者中效果更显著。然而，芦可替尼在器官保存中的应用此前未见报道。基于上述背景，研究人员探讨了芦可替尼作为静态冷保存补充剂对老年供体心脏的作用。

二、研究设计与技术方法

研究人员使用24月龄雄性及雌性C57BL/6J小鼠（购自法国Janvier公司）作为老年供体模型。实验分为四组：对照组（不行心脏停搏和静态冷保存）、HTK冲洗组（仅用HTK溶液冲洗，不保存2小时，用于确定冲洗本身的单独效应）、HTK组（HTK溶液冲洗后4°C静态冷保存2小时）和HTK+Ruxo组（HTK溶液中加入芦可替尼至终浓度10nM，芦可替尼溶于20μL DMSO，HTK组加入等量DMSO作为溶剂对照，实验外科医生对是否添加芦可替尼设盲）。每组及每个性别各5只。

主要技术方法包括：采用Langendorff离体心脏灌注系统进行心脏灌流和功能评估，通过左心室球囊导管测定收缩功能参数；采用基于Luminex的多因子检测方法测定首次冠状动脉流出液中的衰老相关分泌表型相关细胞因子浓度；采用蛋白质印迹法（Western blot）检测JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Akt、pAkt、mTOR和p-mTOR蛋白水平；采用免疫组织化学染色检测硝基酪氨酸（nitrotyrosine，硝化应激标志物）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）结合Fisher's LSD或Games-Howell校正，以及双因素方差分析评估处理*性别的交互效应，细胞因子比较采用Benjamini-Hochberg校正。

三、研究结果

心室功能。 对照组心室功能较基线无变化。在两种性别心脏中，HTK冲洗组与对照组的收缩性和心室舒张功能相当。在雌性小鼠心脏中，HTK组的发育压（DP）、最大压力增量（dp/dt_max）和收缩性指数（CI）显著低于对照组或HTK冲洗组；HTK+Ruxo组的DP和dp/dt_max显著高于HTK组，dp/dt_min也更高但未达显著。在雄性小鼠心脏中，HTK+Ruxo组的相对DP、dp/dt_max、CI和dp/dt_min均高于HTK组，但仅dp/dt_min的改善具有统计学意义。双因素方差分析显示，处理因素对所有功能参数的F值均较高且具有显著效应，而性别及处理*性别的交互效应均不显著。

衰老相关分泌表型相关细胞因子释放。 在雌性小鼠心脏中，HTK-Ruxo组较HTK组释放更少的IL-10、IL-1α、IL-7、IL-13、TNF-α、CCL5和CD27。在雄性小鼠心脏中，HTK-Ruxo组CXCL5释放减少、CD27释放增加，CCL11释放也减少。雌性心脏中CXCL5、ICAM1、CCL2和CCL8的释放在两组间相当，雄性心脏中CRP、TNF-α、IL-7、G-CSF和CCL2相当。雌性心脏中CRP和CCL11释放增加，雄性心脏中CCL8释放增加。IL-6、IL-13和G-CSF浓度勉强高于检测限，GM-CSF、GRO-α、IL-1β、IL-15、IP-10、M-CSF、CXCL9、CCL3和VEGFA低于检测限。

JAK2/STAT3通路。 蛋白质印迹分析显示，雄性小鼠心脏HTK组中JAK2磷酸化非显著性升高，HTK+Ruxo组中JAK2磷酸化显著降低并与对照组相当。雌性小鼠心脏中JAK2磷酸化在各组间无显著差异。两种性别心脏中所有组的STAT3磷酸化均高于对照组。

Akt通路。 雌性供体心脏中Akt磷酸化在各组间相当。雄性供体心脏中，HTK+Ruxo组pAkt水平升高，HTK冲洗组pAkt水平也意外升高。

硝化应激与eNOS。 两种性别供体心脏中，HTK组硝基酪氨酸表达均较高；HTK-Flush组和HTK+Ruxo组硝基酪氨酸水平与对照组相当。eNOS表达在各组间仅存在微小差异，HTK组表达略低。

四、讨论与结论

功能与分子分析表明，仅用HTK溶液冲洗供体心脏而不进行后续保存，不影响心室功能、JAK2/STAT3通路、硝化应激或eNOS表达。因此，两种性别心脏在静态冷保存后的功能下降主要归因于冷保存本身。预期的深度功能下降反映了老年供体心脏对静态冷保存的耐受性较低，这与老年供体心脏移植后PGD发生率较高一致。本研究中未能证明性别对老年供体心脏心室功能障碍发生的潜在影响，这可能涉及供体/受体性别匹配/不匹配的复杂交互作用。幸运的是，在HTK静态冷保存期间添加芦可替尼，可使雌性老年供体心脏的心室收缩和舒张功能完全维持，雄性老年供体心脏部分改善。由于处理与性别的交互效应不显著，本研究未能证明性别对芦可替尼效应的显著影响。

研究人员假设衰老相关分泌表型相关细胞因子是此背景下心脏功能下降的重要促成因素。雌性小鼠心脏中，IL-1α、IL-10、TNF-α和IL-7等细胞因子在HTK组的释放量高于HTK+Ruxo组；但雄性小鼠心脏中这些细胞因子在两组中的释放浓度较低或检测不到。雄性小鼠心脏中JAK2磷酸化被诱导，因此芦可替尼处理的雄性供体心脏中pJAK2低于HTK组；但令人意外的是，JAK2调控的改变并未积极影响收缩功能，也未导致STAT3调控的变化。雌性小鼠心脏中pSTAT3水平在HTK和HTK+Ruxo组间相当，无法解释细胞因子浓度的差异。雌性心脏中HTK与HTK+Ruxo组间细胞因子浓度的差异提示衰老相关分泌表型相关细胞因子特异性地参与了组间功能差异，但JAK/STAT调控修饰以外的其他机制可能也参与其中。磷酸化可能是短暂的，在较长时间后可能无法观察到。

Akt通路方面，雄性供体心脏中HTK+Ruxo组pAkt高于HTK组，但HTK冲洗组pAkt也升高，因此Akt通路在雄性心脏中的参与仍需进一步验证；雌性小鼠心脏中未发现组间实质性差异，Akt通路似乎未参与雌性小鼠心脏的功能差异。

研究结果还显示，HTK组的功能恶化伴随硝化应激增加，而将芦可替尼加入HTK可降低两种性别老年供体心脏的硝化应激，可能改善心肌保护。芦可替尼本身不具有活性氮清除特性，但HTK+Ruxo组中降低的IL-1α和TNF-α参与活性氮和活性氧的产生，因此硝化应激的降低可能源于相应细胞因子释放的减少。eNOS表达在各组间相当，在此背景下作用较小。

雌性体内衰老相关分泌表型相关细胞因子水平较高，理论上可归因于男性-女性健康-生存悖论：女性往往寿命更长但健康状况更差、衰弱程度更高，即使与同龄男性相比也是如此；女性随年龄增长的内在能力和韧性下降幅度也更大。较低的韧性和较高的衰弱程度与较高水平的衰老相关分泌表型相关促炎细胞因子相关，这与本研究中雌性心脏静态冷保存后首次冠状动脉流出液中IL-1α、IL-10、TNF-α和IL-7水平升高一致。

本研究存在局限性：基于动物实验而非人类数据；未进行原位心脏移植，限制了离体再灌注和功能分析的可解释性；样本量较小，结果应视为探索性；未进行随机化。未来研究还应探讨芦可替尼的疗效能否推广至年轻供体心脏。

结论： 基于研究数据，衰老调节剂芦可替尼在添加到保存液（本研究中为HTK）中时，可显著改善静态冷保存后老年供体心脏移植物（cardiac allografts）的功能，此效应在女性供体心脏中可能更为显著。该效应有望降低老年供体心脏原位移植后原发性移植物功能障碍的发生率。若本研究结果能转化为原位心脏移植模型，将为老年供体心脏的临床移植应用迈出又一里程碑，从而部分缓解器官短缺问题。然而，考虑到衰老、衰老相关分泌表型和缺血再灌注损伤在心脏中与性别相关差异的复杂交互作用，仍需大量工作来阐明其潜在机制。