猪屠宰场环境与废水中抗菌药物耐药性监测——追踪ESKAPE细菌及产ESBL/碳青霉烯酶大肠杆菌

《Frontiers in Microbiology》：Antimicrobial resistance in environment and wastewaters of a swine slaughterhouse – tracking ESKAPE bacteria and ESBL-/carbapenemase-producing Escherichia coli

　　

摘要 引言： 本研究调查了意大利中部某猪屠宰场的废水及地面拭子中特定ESKAPE细菌及产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）/碳青霉烯酶大肠杆菌（Escherichia coli）的发生情况、抗菌药物耐药性（AMR）特征及基因组特性。 方法： 通过整合不同操作阶段的微生物学与基因组学分析，研究人员观察到抗菌药物耐药菌（ARB）在屠宰场环境中的持续存在与传播。 结果： E. coli 是所有样本基质中最常见的菌种（39.6%），证实其作为粪便与环境污染指示菌的作用。尽管经过了清洁与净化处理，仍有少量ARB和抗菌药物耐药基因（ARGs）持续存在，尤其是在废水中，这反映了常规卫生与处理措施的部分有效性。药敏试验显示，对氨苄西林（47.2%）、四环素（41.2%）和甲氧苄啶（34.0%）的耐药率较高，近三分之一的样本中存在多重耐药菌株。全基因组测序鉴定了耐药组，例如 blaTEM、blaCTX-M 和 blaOXA-48 基因。在处理后的废水中检测到 blaNDM，凸显了碳青霉烯酶产生菌向环境扩散的潜在风险。系统发育分析揭示了产OXA和ESBL的 E. coli 及鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）在不同样本间的克隆持续性，而牲畜相关耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）ST398则表明存在局部污染事件。 讨论： 这些发现表明，屠宰场生态系统可作为AMR的活跃储存库和传播节点。

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（AMR）被视为全球重大公共卫生威胁。AMR通过垂直基因转移和由移动遗传元件（MGEs，如质粒、整合子和转座子）介导的水平基因转移（HGT）在人类、动物和环境微生物组中发展与传播，构成了强调“同一健康”（One Health）框架重要性的复杂问题。研究表明，从农场到屠宰场、最终产品及污水的生猪供应链中，每个生产环节都可能成为MGEs的储存库。其中，最令人担忧的多重耐药（MDR）病原体包括所谓的ESKAPE细菌（肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌属）以及产ESBL或碳青霉烯酶的 E. coli。在屠宰场环境中，耐药微生物可通过多种途径传播，包括引入定植动物、剖腹过程中使用受污染水以及胴体接触受污染表面。即使经过现场或市政污水处理厂（mWWTPs）的处理，出水仍常含有抗菌药物残留和耐药菌（ARBs），导致其在环境中扩散。已有研究在猪屠宰场废水中发现了产ESBL的 E. coli、K. pneumoniae 及粘菌素耐药菌，并伴有高比例的MDR分离株。此外，地板和排水系统因积水、血液和有机物残渣积累，成为ARBs持续存在的热点。尽管国际证据日益增多，但意大利尚缺乏针对猪屠宰场废水中临床相关ARBs发生情况及基因组特征的综合性研究。此前无意大利研究同时涵盖废水处理前后及环境表面采样，全面调查ESKAPE细菌及产ESBL/碳青霉烯酶 E. coli 的流行率、耐药谱和基因组特性。因此，本研究旨在报告在一家猪屠宰场收集的废水和环境拭子样本中特定ESKAPE细菌（尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、鲍曼不动杆菌、产ESBL/碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）的流行率，并评估消毒和水净化过程前后细菌检出率的差异。

二、研究方法概述

研究人员于2025年1月至7月间，在意大利中部一家猪屠宰场每两周进行一次采样，共12次。每次采集4份废水样本（净化前、后各2份）和8份地面拭子样本（分别来自预分割区PRE-SEC和后分割区POST-SEC，并在操作前后采集），共计96份样本。所有样本冷藏运输至布雷西亚伦巴第与艾米利亚罗马涅实验动物预防研究所（IZSLER），24小时内完成分析。关键技术方法包括：（1）采用0.45 μm滤膜过滤废水后进行选择性培养基增菌与分离；（2）利用MALDI-TOF质谱法（Vitek MS plus）及Clermont分型PCR确认菌种；（3）通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）进行药敏试验（AST），依据EUCAST标准判读；（4）采用多重PCR检测ESBL基因（bla_CTX-M、bla_SHV、bla_TEM、bla_CMY）、碳青霉烯酶基因（bla_VIM、bla_IMP、bla_KPC、bla_NDM、bla_OXA-48、bla_GES-5）、粘菌素耐药基因（mcr）及MRSA相关基因；（5）选取22株代表性MDR菌株进行Illumina短读长全基因组测序（WGS），通过BV-BRC平台组装注释，利用丹麦技术大学（DTU）基因组流行病学中心服务进行耐药组分析、质粒鉴定、k-mer分析和单核苷酸多态性（SNP）分析；（6）采用双因素方差分析（ANOVA）检验样本类别（CLEAN vs. DIRTY）和区域对细菌计数的影响。

三、研究结果

3.1 目标菌种阳性样本的流行率

共96份样本中，50份（52.1%）至少检出一种目标微生物，获得80株分离株。按基质分类，废水样本阳性率（70.8%，34/48）显著高于地面拭子（33.3%，16/48）。在废水中，DIRTY样本阳性率（83.3%）高于CLEAN样本（58.3%）；在地面拭子中，DIRTY样本阳性率（54.2%）远高于CLEAN样本（12.5%）。指示 E. coli 是最常检出的微生物，总检出率为39.6%（38/96），在废水中检出率（60.4%）远高于地面拭子（18.75%）。产碳青霉烯酶 E. coli 总体流行率为8.3%（8/96），在废水中更常见（16.7%）。产ESBL E. coli 仅在DIRTY样本中发现（4.2%）。鲍曼不动杆菌仅见于DIRTY样本（8.3%）。金黄色葡萄球菌和MRSA的总体流行率分别为2.1%和1.0%。

3.2 指示大肠杆菌的抗菌药物耐药谱

对53株指示 E. coli 的药敏试验显示，最常见耐药为氨苄西林（47.2%）、四环素（41.5%）、甲氧苄啶（34.0%）和氯霉素（22.6%）。对替加环素（5.7%）、环丙沙星（3.8%）、阿奇霉素（3.8%）、美罗培南（1.9%）和庆大霉素（1.9%）的耐药罕见。所有菌株对阿米卡星、头孢噻肟、头孢他啶、粘菌素和萘啶酸完全敏感。DIRTY样本分离株对多数抗生素的耐药率高于CLEAN样本。MDR菌株（对≥3类抗生素耐药）占全部指示 E. coli 的32%（17/53），其中DIRTY样本占比（24.5%）高于CLEAN样本（7.5%）。

3.3 其他分离株的特征分析

其余27株分离株中，产碳青霉烯酶 E. coli 最为常见（13.75%，11/80）。所有OXA型菌株携带 bla_OXA-48 基因，另一CARBA型菌株携带 bla_NDM 基因。产ESBL E. coli 均携带 bla_CTX-M 基因，其中一株还携带 bla_TEM。金黄色葡萄球菌中，两株携带 mecA 基因被鉴定为MRSA。产 bla_NDM 的 E. coli 表现出最广泛的耐药谱，对所有测试的碳青霉烯类和头孢菌素类均耐药。MRSA分离株呈现MDR表型，对头孢西丁、克林霉素等七种抗生素耐药。

3.4 选定菌株的基因组学见解

WGS揭示的耐药决定簇与表型耐药谱高度一致。β-内酰胺酶基因（bla_TEM-1B、bla_CTX-M-8、bla_OXA-181 等）与MIC值对应良好。质粒复制子分型在 E. coli 中鉴定出IncF、IncX、IncI1-I(α)、IncR和Col型质粒。SNP系统发育分析显示，4株产OXA E. coli（菌株11-14）形成一个克隆簇（0-1个SNP差异），跨越不同采样日期的废水和地面拭子样本，甚至出现在净化后的CLEAN废水中，表明该耐药克隆能在设施内持续存在并抵抗净化程序。2株产ESBL E. coli（菌株9-10）形成另一个独立克隆簇，均来自连续两个月的地面拭子DIRTY样本，提示局部持续性。指示 E. coli 群体则呈现高度遗传多样性。3株鲍曼不动杆菌（菌株17-19）来自同一天的两份DIRTY废水样本，SNP完全相同，确认为同一采样点的克隆扩增。2株MRSA ST398分离株仅相差21个SNP，表明克隆起源和样本内微进化。

四、讨论总结与研究结论

讨论总结： 研究结果表明，废水样本比地面拭子是更关键的AMR储存库和传播载体。清洁消毒对地面效果显著（阳性率从54.2%降至12.5%），但对废水效果有限（从83.3%降至58.3%），表明废水管理是控制AMR的关键瓶颈。E. coli 的高流行率确认其作为污染指示菌的价值。药敏结果显示耐药主要针对氨苄西林、四环素等传统常用抗生素，但MDR菌株在废水中高达32%，支持屠宰场废水是MDR基因交换和选择热点的假设。WGS发现的 bla_NDM 尤为令人担忧，因其通常主要在临床环境中报道。产OXA E. coli 克隆在净化后废水中的检出表明该谱系能耐受净化程序。MRSA ST398的检出强化了对工人人畜共患传播潜力的关注。系统发育数据证明 E. coli 和 A. baumannii 可在屠宰场环境（尤其通过废水途径）持续存在和再循环，而MRSA则与局部污染事件相关。

研究结论： 总之，本研究表明猪屠宰场环境及相关废水充当着抗菌药物耐药菌和临床相关耐药基因（包括产ESBL和碳青霉烯酶的 E. coli、牲畜相关MRSA及 A. baumannii）的储存库。尽管采用了标准的清洁、消毒和废水处理程序，细菌载量和ARGs仍然持续存在，凸显了当前缓解策略的局限性。全基因组测序揭示了多样的耐药谱和质粒，证实了水平基因转移和多重耐药菌株传播的可能性。这些发现强调了采取一体化“同一健康”监测方法的必要性，该方法需结合微生物学、分子生物学和基因组学手段，以监测、预防并最终减轻抗菌药物耐药性从畜牧生产向更广泛环境的传播。